Tài liệu Phân tích đa dạng trình tự nucleotit các vùng tương đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam

ĐỀ TÀI: Phân tích đa dạng trình tự nucleotit các vùng tương đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam

MỞ ĐẦU

Hiện nay, dân số trên thế giới đă là hơn 6 tỉ người và vẫn đang tiếp tục tăng, nguồn lương thực chính được sử dụng là lúa gạo. Châu Á là nơi trồng và tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất với trên 90% tổng sản lượng, trong khi đó, diện tích đất trồng lúa vào khoảng 148 triệu heta chiếm 11% tổng diện tích đất canh tác trên thế giới. Do dân số ngày một tăng mà diện tích đất trồng trọt là có giới hạn nên muốn giải quyết được vấn đề lương thực th́ không c̣n cách nào khác là phải tăng năng suất. Sâu bệnh là một trong những yếu tố cơ bản làm giảm năng suất cây lúa, do đó muốn tăng năng suất th́ phải làm giảm sự thiệt hại do sâu bệnh gây ra. Theo ước tính, bệnh đạo ôn làm thiệt hại trên 55 triệu USD mỗi năm tại Nam Á và Đông Nam Á (Hert,1991), cao hơn tại vựng Đụng Á và cỏc vựng ôn đới khác. Bệnh bạc lá cũng là một trong nhưng bệnh chính hại lúa ở các nước vùng nhiệt đới châu Á trong 3 thập kỉ trở lại đây, ở một số nơi bệnh này làm giảm trên 50% năng suất, mức độ ảnh hưởng của bệnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, điều kiện thổ nhưỡng và mùa vụ (Kameswara, 2002).
Việt Nam nằm ở một vùng được ưu đăi về địa lư và có một nền nông nghiệp trồng lúa nước truyền thống được phát triển từ lâu đời. Nước ta đang là nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới sau Thái Lan với hơn 80% dân số làm nghề nông. Để ngành nông nghiệp đặc biệt là trồng lúa phát triển hơn nữa, Nhà nước ta đă có nhiều sự đầu tư cho nghiên cứu và áp dụng công nghệ sinh học phục vụ cho nông nghiệp. Đối với lúa ở nước ta bệnh bạc lá và đạo ôn cũng là những bệnh chớnh gơy nhiều thiệt hại. Thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với lúa tại Việt Nam là 15-30% (Vien, 1992). Cho tới nay đó cú biện pháp pḥng trừ khá hiệu quả là dùng thuốc trừ sâu hoá học nhưng biện pháp này có nhiều tác động xấu đến con người, hệ vi sinh vật và môi trường. Do đó, việc t́m ra và phát triển những giống lúa có khả năng kháng những bệnh này là mục tiêu của các nhà chọn giống, biện pháp này tỏ ra có hiệu quả kinh tế, không gây ảnh hưởng xấu đến con ngừơi, vi sinh vật có lợi và môi trường.
Người ta đă sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn tạo các giống lúa có khả năng kháng một số bệnh trên. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo ra các giống kháng bệnh đă và đang phất triển ngày càng có hiệu quả lớn. Chính v́ vậy chỳng tôi tiến hành đề tài: “Phơn tích đa dạng tŕnh tự nucleotit cỏc vựng tương đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam” nhằm góp một phần vào công tác chọn tao giống lúa ở nước ta hiện nay.























CHƯƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. SỰ ĐA DẠNG ADN
Trên trái đất của chúng ta có rất nhiều sinh vật, chúng tạo nên sự đa dạng và phong phú rất cao. Chớnh vỡ sự đa dạng đó mà người ta đă xếp sinh vật vào các bậc phân loại khác nhau.
Ở mức vĩ mô người ta chia làm 3 nhỏnh chớnh: Động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong mỗi nhánh người ta lại phân loại theo thang bậc gồm 6 líp: ngành, líp, bộ, họ, chi, loài. Thang phân loại này dùa theo tiêu chẩn h́nh thái, v́ vậy nó vẫn chưa mô tả được hết sự phong phú của thế giới sinh vật nên người ta lại phải sử dụng đến các tiêu chuẩn bổ sung để phân loại sinh vật chi tiết hơn nữa như dưới chi, loài .Vỡ hệ thống phân loại nói trên dùa vào kết quả quan sát đặc điểm h́nh thái, chính v́ vậy mà đă gặp rất nhiều khó khăn khi tiến hành phân loại sâu hơn, trong khi đó sự phân loại dưới loài lại đóng vai tṛ rất quan trọng. Để khắc phục t́nh trạng này người ta phải sử dụng chỉ thị “phi hỡnh thỏi” ở dạng phân tử mà một trong số đó là chỉ thị ADN. Khi nói đến sự đa dạng ADN , nghĩa là sự khác nhau ở mức độ phân tử ADN giữa các cá thể trong cùng một loài sống ở trong một vùng địa lư nhất định. Nghiên cứu đa dạng ADN thực chất cũng là phân loại nhưng ở mức độ ADN để xác định sự khác biệt hay giống nhau giữa hai cá thể cùng loài, chẳng hạn như sự giống hay khác nhau giữa các giống lúa trong cùng một loài phụ mà không thể phân biệt được qua chỉ thị h́nh thái (Lă Tuấn Nghĩa, 2004).
Nghiên cứu đa dạng ADN đóng vai tṛ rất quan trọng, thông qua phân tích tính đa dạng ta có thể chọn được những cặp bố mẹ lai thích hợp trong chọn tạo giống cây trồng. Chẳng hạn, khi tiến hành chọn cặp lai hoặc chọn ḍng ở cây trồng, quan sát đặc điểm h́nh thái cho thấy chúng rất giống nhau, v́ vậy rất khó chọn lọc. Tuy nhiên nếu dùng chỉ thị ADN sẽ giúp chúng ta dễ dàng chọn lọc được những cặp lai thớch ứng hoặc những ḍng mong muốn. Chỉ thị ADN đặc biệt có lợi khi sử dụng để chọn lọc cây trồng có đặc tính khó hoặc không thể quan sát bằng mắt thường nh­ khả năng chịu bệnh, chịu rét, chịu mặn, năng suất .
2. CÁC CHỈ THỊ SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG
2.1. Chỉ thị h́nh thái.
Một tính trạng được coi là một chỉ thị di truyền nếu nó được kiểm soát bởi một locus xác định và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài của môi trường, mặc dù chỉ thị h́nh thái thường được sử dụng là một chỉ thị trội hoặc đồng trội, song trong nhiều trường hợp chúng vẫn bị ảnh hưởng của các yếu tố khác như tương tác gen, nhân tố gen nhẩy và các nhân tố môi trường . Trong các giai đoạn khác nhau của sự phát triển của cơy cỏc đặc điểm h́nh thái cũng khác nhau nờn chỳng không được xem là đặc trưng. Hơn nữa các đặc điểm h́nh thái cũng không nhiều ở mỗi sinh vật, do đó khả năng ứng dụng của chúng c̣n nhiều hạn chế.
2.2. Chỉ thị sinh hoá
Chỉ thị sinh hoá thường là loại chỉ thị có bản chất là Protein. Do các gen trong cơ thể qui định cấu trúc của Protein nên nếu ta biết được cấu trúc của phân tử Protein th́ sẽ suy ra được cấu trúc của gen. Các phân tử izozym có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong gel khi điện di. Sau khi nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc trưng và quan sát kết quả điện di trên bản gel ta có thể đánh giá được sự đa dạng di truyền của sinh vật.
Tuy nhiên số lượng kiểu h́nh isozyme trong thực tế là không nhiều, không phân bố trên toàn bộ gen mà thường xuyên bị ảnh hưởng của yếu tố môi trường Hơn nữa, isozyme chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá tŕnh phát triển cơ thể (P. Samee, 1996).


2.3.Chỉ thị phân tử ADN.
Hạn chế của việc sử dụng chỉ thị h́nh thái , chị thị protein là chúng chỉ dùng để nghiên cứu gián tiếp hệ gen của vi sinh vật, do đó người ta đă phát triển nhưng kĩ thuật dùng ngay ADN làm chỉ thị phân tử . Chỉ thị phân tử bao gồm RFLP, PCR . dùng để phát hiện, phân tích và tổng hợp ra những đoạn ADN (hoặc ARN) được sử dụng để lai với ADN của hệ gen cần phân tích .Việc sử dụng chỉ thị ADN đă tạo điều kiện cho các nhà khoa học có thể nghiên cứu trực tiếp hệ gen của sinh vật. Chỉ thị ADN rất phong phú và có tính ổn định cao, hơn nữa chúng ta có thể nghiờn cưỳ ở bất ḱ giai đoạn nào của cá thể. Chỉ thị ADN rất thích hợp cho việc nghiên cứu đa dạng sinh học, lập bản đồ di truyền và chọn tạo giống cây trồng.
2.3.1. Chỉ thị RFLP (Bostein, 1980)
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nghĩa là đa h́nh độ dài các mảnh giới hạn. RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axitnucleic. Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa trờn sự phân cắt ADN bằng enzym giới hạn và sự lai (liên kết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axit nucleic (sợi ADN hoặc mARN). Khi xử lư ADN bằng các enzym giới hạn sẽ thu được những mảnh ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau, những mảnh này sau đó được điện di trên gel agaroza 0.8%. Tiếp theo người ta chuyển các mảnh ADN lên một màng lai theo nguyên tắc thẩm thấu giữ nguyên vị trí (Southen Bloting), sau đó người ta cho mẫu dũ cú tŕnh tự nucleotit đă biết trước và được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng chất hoá học lai với ADN cố định trên màng lai, nếu chúng bổ sung với nhau th́ sẽ cho phản ứng lai. Kết quả của phản ứng lai sẽ được phát hiện bằng cách nhuộm màu hoặc dùng phóng xạ qua phim X-quang. Dùa vào những băng ADN chóng ta có thể xác định được sự đa h́nh giữa các mẫu ADN khác nhau (Bựi Chớ Bửu, 1999).
Chỉ thị RFLP được ứng dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền, sự phơn hoỏ trong di truyền huyết thống và lập bản đồ gen: lập bản đồ di truyền trên cây lúa (Mc.Couch và cs, 1988), lập bản đồ gen cho bệnh đạo ôn (Yu và cs, 1991), bệnh bạc lá (Ogawa, 1987; Kinoshita, 1991), bệnh rầy nâu (Lang và cs, 1999), bệnh sâu đục thân (Tan và cs, 1993).
2.3.2. Chỉ thị PCR
1. Khái niệm:
PCR (Polimerase Chain Reaction) hay phản ứng chuỗi polimeraza là mét quá tŕnh cho phép nhân nhanh các đoạn ADN trong một khoảng thời gian ngắn .Kỹ thuật này do Kary Mullis phát minh năm 1985.
Nguyên tắc: Nhờ enzym ADN polymeraza xúc tác, trờn cỏc mạch khuôn ADN tổng hợp nờn cỏc mạch đơn mới, các mạch đơn vừa được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá tŕnh tổng hợp mach mới của chu ḱ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch ADN mới cần có sự tham gia của các đoạn ADN mồi làm xuất hiên những nhóm 3’OH tự do,cỏc nucleotit được gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài tạo thành mạch đơn mới, chiều tông hợp là chiều 5’-3’.
2. Các bước tiến hành.
Kỹ thuật PCR gồm 3 bước:
a) Giai đoạn biến tính: Giữ nhiệt độ khoảng 94-95[SUP]0[/SUP]C trong 30’ đến 1 phót để phá vỡ các liên kết hydro giữa 2 mạch ADN để tạo thành sợi đơn. Nếu đoạn khuụn cú tỉ lệ G-C cao, chuỗi G, C liền nhau càng dài th́ nhiệt độ biến tính sẽ cao hơn do đó cần tính toán để có nhiệt độ và thời gian phù hợp.
b) Giai đoạn gắn mồi: Hạ nhiệt độ xuống khoảng 30- 60[SUP]0[/SUP]C trong 30’ đến 1 phút , cỏc mồi sẽ bắt cặp với khuôn .
c) Giai đoạn tổng hợp: Giữ nhiệt độ ở 72[SUP]0[/SUP]C là nhiệt độ thích hợp nhất với sự hoạt động của enzym polymeraza, ADN mới sẽ được tổng hợp theo chiều 5’-3’ bắt đầu từ vị trí gắn mồi.
Sau mỗi chu ḱ, một đoạn ADN được nhân lên thành 2, các ADN được nhân lên lại được sử dụng làm khuôn cho quá tŕnh sau, sau n chu kỳ ta có 2[SUP]n[/SUP]đoạn ADN.


3. Thành phần phản ứng.
a) Khuôn:
Khuôn có thể là ADN mạch đơn hoặc mạch kép thậm chí cả ARN. Khuụn đ̣i hỏi phải có độ tinh sạch cao, nồng độ thích hợp khoảng 50- 100 ng, nếu Ưt quá th́ phản ứng sẽ không thể xảy ra, nếu cao quá th́ sẽ h́nh thành sản phẩm phụ không mong muốn và làm giảm độ nét của các băng ADN.
b) Mồi:
Là những đoạn oligonucleotit dài khoảng 6-10 nucleotit (mồi ngẫu nhiên) hoặc từ 18-24 nucleoitit (mồi đặc trưng). Nồng độ thích hợp là từ 100-500 nM.
Nồng độ thấp sẽ không đủ cho phản ứng do đó sẽ không tạo băng ADN hoặc nếu có băng th́ nồng độ ADN sẽ rất thấp, ngoài ra cần phải chọn các mồi sao cho không có sự bắt cặp giữa chúng làm giảm hiệu quả phản ứng.
c) Enzym Taq:
Được tách chiết từ vi khuẩn Themus aquticus hay sống ở suối nước nóng có khả năng chịu nhiệt cao được dùng thay cho enzym Klenow tách chiết từ VK E.Coli không chịu được nhiệt. Enzym Taq có trọng lượng phân tử (TLPT) 94 kD và nhiệt độ hoạt động tối ưu là 72[SUP]0[/SUP]C, nếu tăng nhiệt độ lên 95[SUP]0[/SUP]C trong 20’ để biến tính ADN sợi kép thành sợi đơn th́ hoạt tính enzym c̣n lại 65% sau 50 chu ḱ phản ứng. Nồng độ thích hợp là 0,5-2,5 đơn vị.
c) MgCl[SUB]2[/SUB]:
Ion Mg[SUP]2+[/SUP] có ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng vỡ nú ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzym polymeraza, tạo phức chất tan với dNTP, nồng độ Mg[SUP]2+[/SUP] phô thuộc vào nồng độ dNTP, pyrophosphat tù do (PPi) và EDTA là những hợp chất liên kết với những ion có trong dung dịch. Nồng độ thích hợp cho phản ứng là từ 0.5-5mM.