Thạc Sĩ Phân loại, nuôi trồng và khảo sát sơ bộ các chất có hoạt tính sinh học của loài vân chi đỏ tại việt

MỞ ĐẦU

Trametes là nấm có khả năng hóa sube, tai nấm khi khô trở nên cứng giòn.
Trên thế giới có khoảng 50 loài thuộc chi Trametes, trong số đó có một số loài là
nấm phá gỗ, nhưng cũng có một số khác thuộc chi Trametes là nấm dược liệu. Hiện
nay, đã ghi nhận có khoảng 820 chủng Trametes khắp trái đất [102].
Vân chi đỏ (Trametes sanguinea) là một loài nấm có nhiều ứng dụng tiềm
năng về dược liệu cũng như xử lý môi trường. Các nghiên cứu cho thấy rằng vân
chi đỏ được tìm thấy ở rất nhiều vùng trên thế giới và có một số chất có hoạt tính
sinh học như polysaccharide, saponin, carotenoid, hay alkaloid
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cũng phát hiện nhiều loài vân chi
trong tự nhiên, trong đó có vân chi đỏ. Tuy nhiên, các nghiên cứu về phân loại cũng
như khảo sát các chất có hoạt tính sinh học của nấm có nguồn gốc từ Việt Nam vẫn
còn rất hạn chế. Đề tài nhằm định danh, nuôi trồng và khảo sát sơ bộ các hợp chất
có hoạt tính sinh học của loài vân chi đỏ được phát hiện tại Việt Nam.
Kết quả phân loại dựa trên hình thái và rDNA đã xác định nấm vân chi đỏ
được phân lập là Trametes sanguinea, sẽ là cơ sở cho việc phân loại chi Trametes
nói riêng và các loài nấm lớn khác tại Việt Nam nói chung trong các nghiên cứu
tiếp theo. Ngoài ra, kết quả khảo sát các hoạt chất sinh học sẽ rất có giá trị trong các
nghiên cứu hướng đến việc khai thác các chất có lợi của nấm vân chi đỏ.

MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Mục lục i
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vii
Danh mục các hình vẽ, đồ thị viii
MỞ ĐẦU
Chương 1-TỔNG QUAN
1.1. Vị trí của giới nấm trong hệ thống phân loại học .1
1.2. Phương pháp phân loại nấm 4
1.2.1 Phương pháp phân loại dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý .4
1.2.1.1. Giới thiệu chung về giới nấm 4
1.2.1.2. Ngành Basidiomycota (nấm đảm) .4
1.2.2. Phân loại học giới nấm dựa vào sinh học phân tử .7
1.2.2.1. DNA ribosome .7
1.2.2.2. DNA mã hóa cho enzyme ATPase của ti thể tiểu phần số 6 (atp6) .9
1.2.2.3. DNA mã hóa cho nhân tố kéo dài dịch mã alpha 1 (tef1) . 10
1.2.2.4. Gen mã hóa cho protein RPB1 và RPB2 (rpb1, rpb2) 10
1.2.2.5. Gen mã hóa α-tubulin và β-tubulin (α-tub, β-tub) 11
1.2.2.6. Gen mã hóa cho enzyme cytochrome oxidase (cox) . 11
1.3. Khái quát về nấm được nuôi trồng . 12
1.3.1. Đặc điểm sinh lý nấm trồng 13
1.3.1.1. Nhu cầu dinh dưỡng của hệ sợi nấm 13
1.3.1.2. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý 14
1.3.2. Phương pháp nuôi trồng 15
1.3.2.1. Nguyên liệu trồng nấm 15
ii
1.3.2.2. Kỹ thuật trồng nấm 15
1.4. Nấm dược liệu và dược tính . 18
1.5. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu 21
1.5.1. Polysaccharides 21
1.5.1.1. β- D- glucan 21
1.5.1.2. Các dị polysaccharide (Heteropolysaccharides) . 21
1.5.2. Saponin 22
1.5.3. Steroid 23
1.5.4. Carotenoid 25
1.5.5. Alkaloid 26
Chương 2-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu . 28
2.1.2. Môi trường sử dụng 28
2.1.2.1. Môi trường dinh dưỡng . 28
2.1.2.2. Môi trường nuôi trồng . 29
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 29
2.2.1. Phân lập nấm vân chi đỏ . 29
2.2.1.1. Phương pháp lấy mẫu 29
2.2.1.2. Phương pháp phân lập . 29
2.2.2. Phân loại nấm bằng hình thái và di truyền 29
2.2.2.1. Phân loại nấm bằng hình thái . 29
2.2.2.2. Phân loại dựa trên DNA Ribosome 29
2.2.3. Khảo sát một số đặc điểm sinh lý của hai loài nấm vân chi . 31
2.2.3.1. Khảo sát tốc độ lan tơ 31
2.2.3.2. Hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc . 32
2.2.4. Trồng để thu nhận nấm . 32
2.2.4.1. Chuẩn bị meo giống cấp 2 . 32
2.2.4.2. Chuẩn bị meo cọng 32
iii
2.2.4.3. Trồng nấm trên giá thể mạt cưa . 32
2.2.4.4. Quy trình trồng nấm vân chi 33
2.2.5. Khảo sát các hoạt chất sinh học 33
2.2.5.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học . 34
2.2.5.2. Phương pháp định lượng β-1,3-glucan . 38
2.2.5.3. Phương pháp định tính và định lượng saponin . 39
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu . 42
Chương 3-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phân lập mẫu nấm vân chi đỏ . 44
3.1.1. Hình thái mẫu nấm vân chi đỏ ngoài tự nhiên . 44
3.1.2. Phân lập nấm vân chi đỏ . 45
3.2. Phân loại nấm vân chi đỏ và đen 45
3.2.1. Phân loại nấm bằng hình thái 45
3.2.2. Phân loại bằng sinh học phân tử . 52
3.2.2.1. Kết quả PCR 52
3.2.2.2. Kết quả giải trình tự . 54
3.2.2.3. Xây dựng cây phân loại . 54
3.3. Khảo sát một số đặc điểm sinh lý hai loài nấm . 56
3.3.1. Khảo sát tốc độ lan tơ . 56
3.3.2. Hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc 58
3.4. Nuôi trồng hai loài nấm 59
3.4.1. Nuôi trồng nấm vân chi đỏ 59
3.4.1.1. Chuẩn bị giống 59
3.4.1.2. Quy trình nuôi trồng 60
3.4.2. Nuôi trồng nấm vân chi đen 62
3.4.2.1. Chuẩn bị giống 62
3.4.2.2. Quy trình nuôi trồng 63
3.5. Khảo sát các hoạt chất sinh học 64
3.5.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học 64
iv
3.5.2. Định lượng β-1,3-glucan . 67
3.5.3. Định tính và định lượng saponin . 70
3.5.3.1. Định tính saponin 70
3.5.3.2. Định lượng saponin . 73
Chương 4 -KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận . 74
4.2. Kiến nghị . 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO xi
PHỤ LỤC