Luận Văn Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E. coil gây bệnh tiêu chảy t

Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo
con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế
E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chưa thực sự
hiệu quả trong phòng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng
Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây
bệnh tiêu chảy trên heo.
Chúng tôi phân lập được 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13
chủng tạo được vòng kháng khuẩn với E. coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức
chế sự phát triển của E. coli được kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng
sinh được Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12
giờ ) khi có sự hiện diện của E. coli. Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli
và nhạy cảm với các loại kháng sinh được thử nghiệm trừ colistin

1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Enterotoxigenic E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến trong đường
tiêu hóa của heo và người, chiếm đến 66,7% trường hợp tiêu chảy trên heo còn non và
heo đang cai sữa gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi.
Do tính chất đề kháng rất nhanh đối với nhiều loại kháng sinh của E. coli, thì
việc sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn
đến xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi
khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho người tiêu dùng, do đó sử dụng
probiotic được xem như là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh. Hiện nay
Bacillus subtilis được tập trung nghiên cứu nhiều do có nhiều ưu điểm thỏa mãn được
yêu cầu của sản phẩm probiotic hơn so với các chủng vi sinh vật khác. Mặc dù vậy vẫn
chưa có một sản phẩm probiotic từ Bacillus subtilis có thể ngăn ngừa một cách có hiệu
quả bệnh tiêu chảy. Bên cạnh đó một số sản phẩm probiotic phòng bệnh tiêu chảy trên
thị trường của Việt Nam như Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn được sử dụng
không phải vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng
được nhiều loại kháng sinh (Ngô Thị Hoa, 2000) nên có khả năng phổ biến các gene
kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đường ruột của thú. Do đó tiếp tục phân lập
các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn
E. coli gây bệnh tiêu chảy và không mang các gene kháng kháng sinh là điều cần thiết.
Trước tình hình đó được sự phân công của khoa công nghệ sinh học trường Đại
học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hướng dẫn của Ts. Nguyễn Ngọc Hải
chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và
thử đối kháng với E. coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ”.
1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU
1.2.1 Mục đích
Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh
với chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, nhằm phục vụ cho việc ứng
dụng vào trong chăn nuôi.
1.2.2 Yêu cầu
Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo
ở Đồng Nai và Bình Dương.
Chọn lọc được dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E. coli.
Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E. coli gây bệnh trong
môi trường TSB.
Đánh giá sự an toàn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập được bằng
phương pháp kháng sinh đồ.
Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trường thạch tinh bột 1%.
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 E. coli gây bệnh tiêu chảy
Escherichia coli là vi khuẩn đường ruột gram -, là loài chiếm ưu thế trong
đường tiêu hóa của người và động vật, hầu hết E. coli là những chủng có lợi giúp cân
bằng hệ thống vi sinh vật đường ruột tuy nhiên có một số chủng có khả năng gây bệnh
cho người và động vật, trẻ sơ sinh và động vật còn non dễ bị xâm nhiễm bởi những
chủng gây bệnh khi hệ thống vi sinh vật đường ruột bị rối loạn, cơ thể thú bị suy giảm
miễn dịch, hoặc cơ thể thú nhạy cảm với một số chủng vi khuẩn nhất định. Để có thể
gây bệnh các chủng E. coli này cần phải gắn được vào tế bào thành ruột, tránh sự bảo
vệ của cơ thể vật chủ, gia tăng số lượng sau đó làm tổn thương các tế bào thành ruột,
các loại E. coli gây bệnh khác nhau có cơ chế gây bệnh khác nhau, do đó dựa vào sự
tương tác của E. coli với tế bào thành ruột có thể chia các chủng E. coli gây bệnh thành
ít nhất 6 loại: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC),
enteroaggregative E. coli (EAEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E.
coli (EIEC), diffusely adherent E. coli (DAEC) (12).
Các chủng E. coli gây bệnh còn được phân biệt với nhau bằng các phản ứng
ngưng kết kháng nguyên.
Sự xâm nhiễm của các chủng E. coli gây bệnh dẫn đến các rối loạn trong hệ
thống tiêu hóa, nhiễm trùng đường tiết niệu, rối loạn hệ thần kinh trung ương, sau khi
cố định trên tế bào thành ruột các chủng E. coli này tiết ra độc tố làm tổn thương các tế
bào thành ruột, tất cả những gene qui định độc tính của vi khuẩn được mã hóa trên
cùng plasmid hoặc được tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn,
có một vài tính trạng riêng biệt được mã hóa trên transposome hay phage.
Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E. coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên
heo.
2.2 Enterotoxigenic E. coli (ETEC)
Enterotoxigenic E. coli là những chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra ít nhất là
một thành viên trong trong 2 loại độc tố enterotoxin là: LT (heat-labile toxin), ST
(heat-stable toxin). ETEC có khả năng gây ra hiện tượng tiêu chảy trên heo, trên người
và các loài thú khác. Mỗi chủng ETEC có thể mang gene mã hóa cho 1 loại độc tố
hoặc có thể cả 2 loại độc tố khác nhau, những gene này có khả năng cùng được biểu
hiện và gây bệnh cho tế bào vật chủ, trong đó thì LT có ảnh hưởng rất lớn đối với độc
tính của vi khuẩn (11).
2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT
LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt có cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với
cholera enterotoxin (CT) được sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hóa cho cấu trúc
của độc tố LT nằm trên plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae. LT có hai
nhóm chính là LT-1 và LT-2, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn dịch chéo với
nhau. LT-1 được biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên người và động vật
còn LT-2 chỉ được tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập được trên động vật và
một số rất ít chủng phân lập được trên người tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy
LT-2 có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập chung chủ yếu
vào LT-1.
2.2.1.1 Cấu tạo của LT-1
LT1-1 trọng lượng phân tử là 86 kDa được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A có trọng
lượng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B có trọng lượng phân tử 11,5 kDa, 5 tiểu đơn
vị B sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự
phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 nối với nhau bằng cầu nối disulfic, LT-1 có
hai loại là LTh-1 có độc tính trên người và LTp-1 có độc tính trên heo.
2.2.1.2 Cơ chế tác động của độc tố LT-1
Sau khi gắn vào màng tế bào chủ LT-1 được chuyển vào trong tế bào, mục tiêu
của LT-1 là adenylate cyclase, enzyme này nằm trên lớp màng phân cực của tế bào
biểu mô ruột. Tiểu đơn vị A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase hoạt động chuyển
ADP từ NAD gắn vào tiểu đơn vị alpha của protein liên kết với GTP làm hoạt hóa hoạt
tính adenylate cyclase của tiểu đơn vị này, quá trình gắn ADP vào tiểu đơn vị làm
adenylate cyclase hoạt động liên tục từ đó gia tăng hàm lượng cAMP nội bào, khi hàm
lượng cAMP nội bào tăng, cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A,
enzyme này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào
biểu mô ruột, sự phosphoryl hóa dẫn đến sự gia tăng hoạt động của kênh do đó ion
clorua sẽ bị tiết ra ngoài qua các khe tiết đồng thời ức chế sự hấp thụ NaCl từ bên
ngoài vào bởi các tế bào lông ruột, do đó tăng nồng độ ion trong ruột làm nước bên
trong tế bào bị kéo ngược ra ngoài và dẫn đến hiện tượng tiêu chảy bên cạnh đó còn có
các cơ chế khác liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) và sự đáp ứng miễn dịch
của tế bào thành ruột với độc tố cho nên có ít nhất một cơ chế tác động đồng thời với
cơ chế tăng hàm lượng cAMP.
LT bị sử lý để mất hoạt tính ADP-ribosyltransferase còn có tác động như một tá
dược.
LT-2 có 55 – 57 % tương đồng với LT-1 ở tiểu đơn vị A, nhưng không cho thấy
sự tương đồng ở tiểu đơn vị B, LT-2 có hai kiểu kháng nguyên khác nhau là LT-2a và
LT-2b hai kiểu kháng nguyên này có sự tương đồng với nhau là 71% ở tiểu đơn vị A
và 66% ở tiểu đơn vị B. LT-2 có cơ chế tác động tương tự LT-1 là gia tăng hàm lượng
cAMP nội bào, khác biệt là receptor của LT-2 là GD1 còn của LT-1 là GM1, tuy nhiên
như đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-2 gây độc cho tế bào của
người và động vật.
2.2.2 Độc tố kháng nhiệt (heat-stable toxin ST)
ST là protein nhỏ chỉ được cấu tạo từ một đơn vị, nhưng trong cấu trúc chứa
nhiều amino acid cystein, do đó trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính
chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố. Độc tố này có hai loại, có cấu trúc
và cơ chế hoạt động khác biệt nhau là STa và STb, gene mã hóa cho hai loại độc tố
này được được qui định trên plasmid, một số gene được phát hiện nằm trên transposon.
2.2.2.1 Độc tố kháng nhiệt STa
STa có trọng lượng phân tử là 2kDa, có hai dạng khác nhau là STap trong cấu
trúc chứa 18 amino acid có khả năng gây độc cho heo và người, dạng còn lại là STah
cấu tạo từ 19 amino acid chỉ gây độc cho người. Ban đầu STa được tổng hợp dưới
dạng pre-protoxin chứa 72 amino acid, sau đó được phân cắt thành peptide có 52 acid
amine, dạng peptide này được chuyển vào vùng periplasm sau đó hình thành cầu nối
disulfic nhờ enzyme DsbA được mã hóa trên genome của vi khuẩn, sau đó dạng
protoxin sẽ được cắt thành dạng toxin hoàn chỉnh và được khuếch tán qua vách tế bào.
Ngoài ETEC ra thì STa còn được tổng hợp bởi một vài chủng vi khuẩn gram (–) khác
như Yersinia enterocolitica và V. cholerae non-O1, bên cạnh đó STa có 50% protein
tương đồng với độc tố EAST1 ST của EAEC.
Receptor của STa là enzyme xuyên màng được gọi là guanylate cyclase C
(GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột, protein này là
receptor của hormone guanylin của thú, hocmone này có 15 amino acid trong đó có 4
cystein đóng vai trò giúp cân bằng trạng thái bình thường của ruột, cơ chế tác động của
receptor này với guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đó là cơ chế receptor gắn
với ligand tiếp nhận các thông tin ngoại bào từ đó thúc đẩy sự hoạt động của các
enzyme nội bào. Tương tự như vậy sau khi liên kết với receeptor STa thúc đẩy họat
tính guanylate cyclase của enzyme này làm gia tăng hàm lượng cGMP nội bào, cGMP
hoạt hóa protein kinase G hoạt động của enzyme này làm tăng hoạt động của kênh
clorua, làm đẩy mạnh việc tiết ion clorua và ức chế sự hấp thu NaCl dẫn đến dịch ruột
bị tiết ra ngoài gây nên hiện tượng tiêu chảy. Độc tố STa tác động nhanh hơn LT do
không cần phải chuyển vào bên trong tế bào mà truyền tín hiệu trực tiếp vào bên trong.
Ngoài GC-C ra thì STa có thể còn có các receptor khác tuy nhiên GC-C là receptor
chiếm ưu thế nhất.
2.2.2.2 Độc tố kháng nhiệt STb
STb ban đầu cũng được tổng hợp dưới dạng pretoxin có 72 acid amine sau đó
được chế biến thành dạng protein hoàn chỉnh có 48 acid amine, protein này có trọng
lượng phân tử là 5,1kDa, cấu trúc của STb không tương đồng với STa mặc dù trong
cấu tạo của nó cũng có 4 amino acid cystein, STb làm tổn thương các tế bào ruột do
tác động lên các lông ruột dẫn đến các lông tơ trên tế bào biểu mô bị mất hoặc bị thu
ngắn lại, receptor của STb vẫn chưa được xác định có thể độc tố này gắn vào những
vùng không chuyên biệt trên màng tế bào trước khi được đưa vào trong, tác động của
STb trong tế bào không giống như STa thay vì phân tiết clorua, độc tố này dẫn đến
việc phân tiết bicarbonat, STb không làm gia tăng hàm lượng cAMP hay cGMP nội
bào mà tác động của nó làm tăng hàm lượng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên
ngoài, ngoài ra tác động của nó còn làm tăng sự phân tiết PGE2 và serotonin cho thấy
tác động của STb có liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS).
Cơ chế tác động của độc tố LT và ST được trình bày ở hình bên dưới
2.2.3 Các yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC
Để có thể gây bệnh các chủng ETEC phải gắn được vào thành tế bào biểu mô
ruột, khả năng gắn được vào thành tế bào ruột non càng lớn thì mức độ gây bệnh càng
lớn, việc gắn vào thành tế bào ruột được thực hiện bởi một thành phần trên lớp capsule
của vi khuẩn gọi là fimbriae, fimbriae có cấu tạo nhỏ và chiếm một số lượng lớn hơn
tiêm mao (flagella) của vi khuẩn, fimbriae có nhiều hình dạng và cấu trúc khác nhau,
mỗi fimbriae có một receptor chuyên biệt trên thành biểu mô ruột các receptor này có
cấu tạo là IMTGP (intestinal mucin-type glycoprotein). Fimbriae xuất hiện trên cả vi
khuẩn E. coli gây bệnh cũng như không gây bệnh nó giúp cho vi khuẩn chống việc bị
loại thải bởi nhu động ruột, một vi khuẩn có thể có nhiều loại fimbriae khác nhau,
fimbriae nằm trên capsule cho nên kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên K tuy nhiên
nó được cấu tạo là protein nên còn được gọi là kháng nguyên F, các fimbriae khác
nhau được phân biệt bằng hình thái và khả năng ngưng kết hồng cầu.
Mỗi loại ETEC gây bệnh cho những loài khác nhau thường biểu hiện một loại
fimbriae riêng biệt.
2.3 Chế phẩm sinh học (probiotic)
2.3.1 Định nghĩa
Probiotic đã được sử dụng hàng ngàn năm trước khi mà các sản phẩm sữa chua
(yaourt) được sử dụng. Có nhiều định nghĩa khác nhau về probiotic, hiện nay thuật ngữ
probiotic được sử dụng để chỉ những sản phẩm chứa vi sinh vật sống để cải thiện hệ vi
sinh vật nội tại (Trần Thị Dân, 2005). Có nhiều chế phẩm sinh học khác nhau đã được
thương mại hóa, có loại chỉ chứa một loài vi sinh vật, có loại chứa hai hay nhiều loại vi
sinh vật khác nhau. Các loại vi sinh vật có lợi được sử dụng phổ biến nhất là các loài
của lactobacilli, streptococcus, bifidobacterium ssp, bacillus ssp.v.v (2), (9).
2.3.2 Cơ chế tác động
Tuy đã được sử dụng từ rất lâu nhưng cơ chế tác động của probiotic vẫn chưa
được nghiên cứu một cách rõ ràng do hiệu quả tác động của nó chịu ảnh hưởng bởi
nhiều yếu tố khác nhau. Fuller (1992) đã đề nghị cơ chế tác động của probiotic có thể
là (2)
 Cạnh tranh thụ thể kết dính trên biểu mô tế bào tiêu hóa.
 Cạnh tranh chất dinh dưỡng giới hạn với vi sinh vật gây bệnh, tuy nhiên cơ
chế này chưa được chứng minh một cách rõ ràng trong điều kiện in vivo.
 Sản xuất chất kháng khuẩn như các acid hữu cơ, bacteriocin.v.v.
 Kích thích hệ miễn dịch.
Probiotic có giá trị khoa học, tuy nhiên lợi ích của nó chỉ thể hiện khi thú có sức
khỏe kém, stress hoặc xáo trộn hệ vi sinh vật đường ruột (2).
2.3.3 Ứng dụng của chế phẩm sinh học
Probiotic được sử dụng để phòng và chữa trị một phổ lớn các bệnh đường ruột
như là bệnh tiêu chảy do sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh, virus, sử dụng kháng
sinh và dinh dưỡng, bệnh viêm ruột, hội chứng dễ bị kích thích của ruột, ngoài ra còn
được sử dụng để bổ sung các enzyme tiêu hóa mà cơ thể tiết ra không đủ như sucrase,
maltase (9). Các vi sinh vật có lợi trong probiotic sẽ ức chế vi sinh vật gây bệnh để hệ
thống vi sinh vật trong đường ruột có thể phục hồi.
Probiotic giúp cho thú tăng trọng nhanh hơn trên một đơn vị thức ăn do vi sinh
vật trong probiotic tiết ra các enzyme tiêu hóa như amylase, protease làm tăng hệ số
chuyển hóa thức ăn của thú.
2.3.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học
An toàn là điều tiên quyết đối với một chế phẩm sinh học, các chủng vi sinh vật
được sử dụng làm chế phẩm sinh học phải không mang gene gây độc cho người và
động vật.
Chủng vi sinh vật được chọn để làm chế phẩm phải chống chịu được điều kiện
pH thấp của dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hóa đồng thời phải có khả năng bám và tạo
khuẩn lạc trên thành ruột (9).
Chế phẩm sinh học phải cho được hiệu quả cao trong phòng, trị bệnh hoặc trong
cải thiện dinh dưỡng của thú. Vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm sinh học phải có
tính đối kháng mạnh với nhiều chủng vi sinh vật khác nhau hoặc làm tăng hiệu quả sử
dụng thức ăn một cách có ý nghĩa.
Giá thành có ý nghĩa rất lớn đối với sự phổ biến của sản phẩm, vi sinh vật được
tuyển chọn làm chế phẩm sinh học phải phát triển mạnh, qui trình nuôi cấy và sản xuất
phải đơn giản không tốn kém.
Dễ sử dụng và bảo quản, cách sử dụng phải đơn giản, vi sinh vật phải tồn tại
được trong thời gian dài ở điều kiện bảo quản bình thường.
2.3.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis
Điều khác biệt đối với các sản phẩm probiotic khác là các sản phẩm probiotic
có nguồn gốc từ bacillus sp được sản xuất ở dạng bào tử do đó những sản phẩm này có
nhiều ưu điểm hơn so với các sản phẩm khác là dễ sản xuất, giá thành sản xuất rẽ, bào
tử chịu đựng được các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo
quản dài, bào tử có khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu
hóa .Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống bacillus thì Bacillus subtilis
được tập trung nhiều nhất vì các dòng vi khuẩn của Bacillus subtilis không mang
những gene gây độc cho người và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus subtilis
được nghiên cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào
tử của Bacillus subtilis có khả năng nảy mầm được trên phần đầu của ruột non (3).
Điều này làm cho việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic được đẩy
mạnh.
2.4 Bacillus subtilis
2.4.1 Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994). Bacillus subtilis thuộc.
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.4.2 Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn, gram (+), sinh nội bào tử, kích thước 0,5- 0,8àm
x 1,8-3àm là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tế bào ít khi tạo thành chuỗi thường ở
dạng đơn bào, hiện diện nhiều trong đất, nước, trong đường tiêu hóa của người và
động vật.
Hình dạng của Bacillus subtilis trên môi trường TSA là khuẩn lạc khô, có rìa
răng cưa, có đường kính 3-5mm nằm sát trên bề mặt thạch.
Các phản ứng sinh hóa được sử dụng để để khẳng định Bacillus subtilis.
Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải tinh
bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP
(+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+) được tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho
đến thời điểm hiện nay, bộ genome của loài này đã được giải mã toàn bộ, bộ gene có 4
Mbp (23), trọng lượng của bộ genome khoảng 2,4×109 đến 2,6×109dalton đặc biệt
trong genome của Bacillus subtilis có nhiều gene qui định cho khả năng kháng lại
kháng sinh như gene kháng thiostrepton, streptomycin, erythromycin, spectinomycin,
chloramphenicol, penicilin.v.v (8) tuy nhiên bất kể là gene kháng kháng sinh được
qui định trên genome hay trên plasmid nó cũng là nguồn cung cấp gene kháng kháng
sinh cho các vi sinh vật đường ruột.
Ở điều kiện kỵ khí Bacillus subtilis sử dụng nitrate như chất nhận điện tử cuối
cùng, nếu trong môi trường thiếu nitrate thì Bacillus subtilis phát triển bằng cách lên
men.
Trong môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết
các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm) (10). Màng sinh học giúp cho
Bacillus subtilis có ưu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi
trường tự nhiên đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt môi trường giúp cho vi
khuẩn có thể tiếp xúc trực tiếp với oxy trong không khí.
Sản xuất các chất diệt khuẩn khác nhau, có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus
subtilis có khả năng sản xuất nhiều hợp chất kháng khuẩn khác nhau có khả năng ức
chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh như Clostridium perfringens,
Helicobacter pylori, Escherichia coli 078:K80.v.v (5).
Vi khuẩn Bacillus subtilis được ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác
nhau như amylase, protease đồng thời cũng được ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên
men truyền thống natto của Nhật Bản.
Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử, bào tử
có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên có thể đến hàng ngàn năm và có thể phát triển lại
thành tế bào sinh dưỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang được quan tâm để sản xuất ra các
vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gene qui định độc tố thương hàn
vào Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gene này cũng được biểu
hiện để sản xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử (7).
2.5 Kháng sinh được tổng hợp bởi Bacillus subtilis
2.5.1 Giới thiệu
Peptide antibiotic là sản phẩm chuyển hóa bậc hai của nhiều loại vi sinh vật
khác nhau, giúp chúng có ưu thế trong cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi
trường cũng như trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm. Peptide antibiotic có bản chất
là các peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, depsipeptide, peptidolactone, lipopeptide,
được phân thành hai lớp là peptide được tổng hợp bằng ribosome còn được gọi là
bacteriosin, còn lại là lớp peptide không được tổng hợp bằng ribosome (16).
Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như
subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin có bản chất là bacteriocin còn bacilysin,
chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và các lipopeptide có
tính kháng khuẩn là các antibiotic không được tổng hợp bằng ribosome (20).
Bacteriocin được tổng hợp dưới dạng tiền peptide có chứa một đoạn tín hiệu
giúp cho enzyme tiết nhận biết, đồng thời ức chế sự tác động của bacteriocin trong tế
bào, dạng tiền peptide sau đó được chuyển lên màng nguyên sinh chất tại đây xãy ra
các phản ứng biến đổi sau dịch mã, cắt đoạn peptide tín hiệu ở đầu C của tiền chất để
thành dạng hoàn chỉnh, sau đó được tiết ra ngoài bằng phức hợp bơm protein ABC
(ATP-binding cassette transport complex) gắn với màng tế bào chất (16).
Các peptide antibiotic không tổng hợp bằng ribosome thì được tổng hợp bằng
các enzyme có cấu trúc phân tử lớn, bên trong cấu trúc được chia thành nhiều module
khác nhau mỗi module chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt, các
module được sắp xếp theo trình tự tương ứng với trình tự các amino acid trên chuỗi
peptide (16).
Lipopeptide có tính kháng khuẩn được chia thành 3 họ khác nhau là surfactin,
fengycin và iturin, lipopeptide được cấu tạo bằng vòng peptide có cấu tạo từ 7 (họ
surfactin và iturin) hoặc 10 (họ fengycin) amino acid liên kết với nhóm –COOH và
nhóm hydroxy (họ surfactin và fengycin) hoặc nhóm amino (họ iturin) tại vị trí β của
acid béo. Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ C13 đến C16 đối với lipopeptide
thuộc họ surfactin, từ C14 đến C17 đối với họ iturin và từ C14 đến C18 trong trường hợp
của họ fengycin (20).
2.5.2 Peptipe antibiotic được tổng hợp bằng ribosome
2.5.2.1 Subtilin
Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm I lantibiotic, những antibiotic thuộc nhóm
Lantibiotic có tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dương như
Propionibacterium acnes, staphylococci, streptococci và clostridia. Cấu tạo của
subtilin có chứa các amino acid không bình thường lanthionin, β-methyllanthionin, D-
alanin, dehydroalanin, dehydrobutyrin, cầu nối sulfic được hình thành giữa các amino
acid này tạo nên nhiều cấu trúc dạng vòng trong cấu tạo của subtilin. Các amino acid
không bình thường được tạo ra do quá trình biến đổi sau dịch mã của subtilin (28).
Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave
ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với
màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với
các nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận
chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton.
Subtilin được tổng hợp trong pha tăng trưởng và đạt nồng độ cao nhất ở đầu
pha cân bằng (29).
Operon của subtilin gồm có spaS mã hóa cho tiền peptide của subtilin, spaB và
spaC mã hóa cho enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã, spaT mã hóa
cho enzyme chuyển dạng tiền chất của subtilin lên màng tế bào chất , spaR và spaK
mã hóa cho protein điều hòa quá trình tổng hợp subtilin (27), spaI mã hóa cho thành
phần protein của lipopeptide SpaI giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại sự tác động
của subtilin, spaF, spaE, spaG mã hóa cho hệ thống chuyển ABC thực hiện tiết
subtilin ra ngoài môi trường bên ngoài (26). Cấu trúc của subtilin, thứ tự các gene trên
operon spaIEFG được thể hiện ở Hình 2.2 (phụ lục).
Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin.
Sự tổng hợp subtilin được điều hòa bằng hệ thống điều hòa hai thành phần là
protein SpaK và SpaR. SpaK là protein xuyên màng với đầu cuối N nằm trong tế bào
chất. Khi nồng độ vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy tăng cao hoặc có sự hiện diện
của subtilin hay các antibiotic có cấu trúc tương tự (nisin) trong môi trường nuôi cấy.
SpaK tiếp nhận tín hiệu rồi truyền vào bên trong bằng cách tự phosphoryl hóa His ở vị
trí 247 ở đầu N sau đó sẽ chuyển gốc phosphat đến amino acid Asp ở vị trí 51 của
protein SpaR , SpaR sẽ gắn vào promoter thúc đẩy sự biểu hiện của gene spaB, spaT,
spaC, spaS đồng thời cũng điều hòa sự tổng hợp của spaI, spaF, spaE, spaG. Ngoài ra
operon của subtilin còn được điều hòa bởi yếu tố H (27).
Subtilin ban đẩu được tổng hợp ở dạng tiền chất có 56 amino acid, dạng tiền
chất này được SpaT chuyển lên màng tế bào chất, tại đây dạng tiền chất của subtilin
được biến đổi thành dạng subtilin hoàn chỉnh có 32 amino acid. Sau đó subtilin được
chuyển ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC do SpaF, SpaE, SpaG hợp thành.
Lipoprotein SpaI định vị ở bề mặt ngoài của lớp màng tế bào có tác dụng ngăn chặn sự
tác động của subtilin vừa được tiết ra lên màng tế bào chất của Bacillus subtilis (26).
2.5.2.2 Subtilosin
Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria
monocytogenes và Bacillus cereus (24), cấu trúc dạng vòng, tiền peptide có 43 amino
acid, Asn ở vị trí 9 tạo liên kết với Gly ở đầu cuối C, đoạn tín hiệu ở đầu cuối N được
cắt để tạo thành cấu trúc dạng vòng, Phe và Thr được biến đổi sau dịch mã dẫn đến sự
hình thành cầu nối nội phân tử để hình thành dạng antibiotic hoàn chỉnh dạng vòng có
32 amino acid (25). Cấu trúc của subtilosin được thể hiện ở Hình 2.3A (phụ lục).
Toàn bộ gene chịu trách nhiệm cho toàn bộ quá trình tổng hợp subtilosin được
mã hóa trên cùng 1 operon. Operon sbo-alb được điều kiển bởi promotor ở upstream
của sboA, giữa 2 gene sboA và albA có một cấu trúc terminator cho nên các enzyme
chịu trách nhiệm tổng hợp và phân tiết subtilosin được tổng hợp với số lượng ít hơn cơ
chất của nó. Operon của subtilosin bao gồm các gene là sboA mã hóa cho dạng tiền
chất của subtilosin, albA, albF và albE mã hóa cho protein thực hiện các phản ứng
biến đổi sau dịch mã và hoàn chỉnh subtilosin, albB, albC, albD và albG mã hóa cho
protein chịu trách nhiệm cho sự tự đề kháng của Bacillus subtilis với subtilosin (24).
Cấu trúc của operon được thể hiện ở Hình 2.3B (phụ lục).
Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của
subtilin.
Sự tổng hợp của subtilosin được kiểm soát bởi hệ thống điều hòa spo0-abrB, ở
pha tăng trưởng AbrB sẽ gắn trực tiếp với promotor của operon sbo-alb ức chế sự biểu
hiện của operon này, ở đầu phag cân bằng do sự thiếu dinh dưỡng trong môi trường và
nồng độ cao của tế bào (25), các enzyme trên màng của tế bào tiếp nhận tín hiệu, các
enzyme này truyền tín hiệu vào bên trong bằng một loạt các phản ứng phosphoryl hóa
cuối cùng là phosphoryl hóa SpoA, quá trình này cũng là sự mở đầu của quá trình tạo
bào tử, SpoA được phosphoryl hóa sẽ ức chế sự biểu hiện của abrB dẫn đến thúc đẩy
sự biểu hiện của operon sbo-alb. Quá trình dịch mã được thực hiện bởi RNA
polymerase được kiểm soát bởi yếu tố điều hòa A, trong điều kiện thiếu oxy operon
sbo-abl được điều hòa bởi hệ thống truyền tín hiệu ResDE (25), (24).
Tiền chất của subtilocin được tổng hợp ở dạng thẳng có 42 amino acid sau đó
được AlbA và AlbF biến đổi thành dạng hoàn chỉnh. Trong cấu tạo của AlbB có hai
nhóm Cys một ở giữa đoạn cuối N, một ở đầu C , nhóm này được xem là trung tâm S-
Fe là trung tâm hoạt động của các enzyme thực hiện các phản ứng hydrate hóa hoặc
dehydrate cơ chất, còn AlbF trong cấu trúc có một đoạn peptide tương tự như là
peptidase nằm giữa đầu N còn ở đầu C có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein gắn
vào peptide cho nên hai enzyme này được thực hiện các phản ứng biến đổi dạng pre-
subtilocin thành dạng hoàn chỉnh (24).
Sau khi được biến đổi thành dạng hoàn chỉnh thì subtilocin được tiết ra ngoài
chủ yếu bằng AlbC có sự tham gia của AlbD. AlbB có tác dụng giữ cho Bacillus
subtilis tránh được sự tác động của subtilocin (24).
2.5.2.3 Sublancin
Sublancin thuộc nhóm AII lantibiotic vì trên đoạn peptide tín hiệu có 1 motif
GS kế tiếp nó là một site cắt, do đó sublancin được tiết ra ngoài bằng hệ thống chuyển
ABC hai chức năng là cắt đoạn peptide tín hiệu và tiết sublancin ra môi trường, trong
cấu tạo có 3 cầu nối nội phân tử gồm 2 cầu nối disulfic của 4 Cys và một cầu nối sulfic
của -methyllanthionine và dehydrobutyrine, tương tự như antibiotic thuộc họ
lantibiotic, sublansin không tác động với vi khuẩn gram âm nhưng có khả năng ức chế
mạnh đối với vi khuẩn gram dương kể cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử. Sublancin là
bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình thường trong thời gian 2 năm không làm
mất hoạt tính của sublancin (21).
Operon của sublancin gồm các gene sunA, sunT, bdbA, bdbB, bdbC, và bdbD.
SunA là tiền peptide của sublancin có 56 amino acid sau đó đoạn tín hiệu bị cắt đi
trong quá trình phân tiết tạo thành dạng hoàn chỉnh có 37 amino acid, sunT mã hóa cho
hệ thống chuyển ABC vì trong cấu trúc của SunT có 4 cấu trúc xuyên màng, ở đầu N
tồn tại domain có hoạt tính peptidase, còn ở đầu C là domain liên kết với ATP
(21).Gene bdbB là gene quan trọng cho sự tổng hợp sublancin nó mã hóa cho enzyme
xúc tác phản ứng tạo cầu nối disulfic giữa hai Cys bên trong cấu tạo của sublancin,
bdbA, bdbC và bdbD thì không có tác động lớn đối với việc tổng hợp sublansin. Cấu
trúc của sublancin, trình tự amino acid và cấu trúc operon của sublancin được trình bài
ở Hình 2.4 (phụ lục).
2.5.2.4 TasA
TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng
khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử
được bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào
tử sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus
subtilis chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (30).
Operon của TasA bao gồm 3 gene là yqxM, sipW và tasA. yqxM là gene mã hóa
cho kháng sinh được tổng hợp trong môi trường có nồng độ muối cao (32), SipW chịu
trách nhiệm cắt đoạn peptide tín hiệu và chuyển TasA ra ngoài môi trường và giữa lớp
màng kép của tiền bào tử trong cấu tạo của SipW có 4 đoạn peptide xuyên màng,
amino acid serine ở vị trí 47 và Histidin ở vị trí 87 là trung tâm hoạt động của đoạn
peptide đóng vai trò là peptidase của SipW (31). Gene tasA mã hóa cho tiền peptide
của TasA. Trong cấu trúc của đoạn peptide tín hiệu ở vị trí 7 và 9 là kế tiếp là một
đoạn peptide kỵ nước (G ở vị trí 10 đến A ở vị trí 15) cấu trúc bậc 3 có dạng α-helic
cho phép đoạn peptide này có thể xuyên màng, kế tiếp là đoạn peptide chứa 3 L, 5
amino acid, kế tiếp là site cắt cho peptidase. Trình tự amino acid tiền chất của TasA và
cấu trúc của operon được được biểu diễn ở Hình 2.5A (phụ lục).
Quá trình điều hòa tổng hợp và phân tiết của TasA.
TasA được tổng hợp ngay đầu phag cân bằng cho nên nó được điều hòa bởi các
yếu tố điều hòa chuyển phag. Tương tự như subtilosin quá trình tổng hợp TasA được
điều hòa hệ thống spo0-abrB nhưng RNA polymerase chịu trách nhiệm dịch mã cho
operon cùa TasA được điều hòa bởi yếu tố điều hòa H (31).
Sau khi được tổng hợp dạng tiền chất của TasA được chuyển lên màng tế bào
chất, hai Lys ở vị trí 7 và 9 mang điện tích dương liên kết với màng tế bào chất, sau đó
đoạn peptide kỵ nước sẽ xuyên qua màng tế bào chất đồng thời kéo đoạn peptide còn
lại xuyên màng sau đó peptidase trong SipW cắt đoạn tín hiệu rồi giải phóng TasA
hoạt động, đoạn tín hiệu sau đó tiếp tục được cắt rồi loại ra khỏi màng tế bào chất (36).
Cơ chế chuyển TasA vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử cũng xãy ra tương tự.
Khác với các loại protein tiết khác TasA sau khi được chuyển qua màng tế bào chất thì
một phần không khuếch tán ra môi trường mà định vị trong lớp peptidoglycan của
vách tế bào Bacillus subtilis và bào tử (33). Vị trí của TasA bên trong vách tế bào và
bào tử được thể hiện ở Hình 2.5B (phụ lục).
2.5.3 Peptide antibiotic không được tổng hợp bằng Ribosome.
2.5.3.1 Surfactin
Surfactin có cấu tạo là lipopeptide do sự liên kết của một chuỗi heptapeptide với
acid béo có một gốc –OH ở vị trí β tạo nên vòng lacton.Chiều dài của chuỗi acid béo
thay đổi từ 13–16 C (20). Surfactin có hoạt tính bề mặt rất mạnh do đó nó có tính đối
kháng mạnh đối với vi khuẩn, virus và kháng lại các tế bào ung thư nhưng ít tác động
đối với nấm. Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp
màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase
(35).
Chuỗi heptapeptide của surfactin có trình tự amino acid là NH2-Gly-Leu-DLeu-
Val-Asp-DLeu-Leu-COOH, chuỗi peptide này được tổng hợp bằng các phản ứng
enzyme. Các gene mã hóa cho các enzyme này nằm trên cùng một operon gọi là srf
operon. srf operon có tất cả 4 gene là srfA, srfB, srfC và srfD. SrfA (402 kDa) là
enzyme hoạt hóa 3 amino acid đó là Gly, Leu, DLeu. SfrB (401 kDa) là enzyme hoạt
hóa 3 amino acid kế tiếp, SrfC (144 kDa) hoạt hóa Leu còn lại và tách chuỗi peptide ra
ngoài.Trong cấu tạo của các enzyme này được được chia thành nhiều modul khác nhau
mỗi modul chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt. Bên trong mỗi
modul được chia thành các domain là domain A (adenylation), domain C
(condensation), domain T (thiolation), domain E (epimerization) mỗi domain thực hiện
một bước trong trong quá trình hoạt hóa amino acid của modul. Domain A thực hiện
phản ứng adenyl hóa cơ chất tạo thành aminoacyladenylate, trung tâm hoạt động của
domain A liên kết với ion Mg2+
. Domain T với cofactor là 4′-phosphopantetheine
(ppan) thực hiện phản ứng hoạt hóa liên kết thioeste. Domain C thực hiện phản ứng
tạo liên kết este giữa 2 amino acid. Trong những modul thực hiện hoạt hóa amino acid
có cấu hình D thì có thêm domain E chịu trách nhiệm chuyển amino acid từ cấu hình L
sang cấu hình D (34). Cấu trúc của surfactin, quá trình điều hòa, cấu trúc của operon
srf, quá trình tổng hợp chuỗi amino acid của surfactin được thể hiện ở Hình 2.6 (phụ
lục).
Quá trình điều hòa và tổng hợp surfactin.
Surfactin được tổng hợp để đáp ứng với nồng độ cao của vi sinh vật trong môi
trường, srf operon được được điều hòa dương bởi ComA. Nhưng quá trình phosphoryl
hóa ComA được điều hòa bởi nhiều yếu tố khác nhau.
Các modul của 3 enzyme SrfA, SrfB, SrfC được xắp xếp theo trình tự tương ứng
với trình tự của amino acid của chuỗi peptide. Khi quá trình bắt đầu Gyl sẽ gắn vào
domain A của modul 1 để thực hiện phản ứng adenyl hóa sau đó được chuyển qua
domain T để tạo phản ứng thioeste với cofactor 4′-phosphopantetheine. Ở modul thứ 2
Leu được gắn vào domain A, domain C của modul 2 thực hiện phản ứng tạo liên kết
este của Gly với gốc amine tự do của Leu sau đó được chuyển qua domain T của
modul 2 để thực hiện các phản ứng tiếp theo. Ở modul cuối cùng có domain TE nhận
biết và tách đoạn peptide ra ngoài (34).
Heptapeptide sau khi được tổng hợp sẽ tồn tại ở dạng vòng hoặc dạng thẳng sau
đó sẽ liên kết với β-hydroxyl acid béo cuối cùng là được tiết ra ngoài.
2.5.3.2 Fengycin (18), (34)
Fengycin là lipopeptide vòng có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm. Fengycin
bao gồm một peptide có 10 amino acid có trình tự L-Glu · D-Orn · L-Tyr · D-allo-Thr ·
L-Glu · D-Ala (D-Val) · L-Pro · L-Glu · D-Tyr · L-Ile với một cầu nối lacton giữa L-Tyr
và L-Ile liên kết với 1 chuỗi β-hydroxyl acid béo có mạch cacbon dài từ 14 đến 18.
Fengycin được tổng hợp nhiều trong phag tăng trưởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối
phag tăng trưởng, fengycin vẫn được duy trì ở nồng độ thấp với hàm lượng ổn định
trong phag cân bằng.
Operon mã hóa cho các enzyme tổng hợp fungycin gồm fenC mã hóa cho
enzyme hoạt hóa cho L-Glu và D-Orn, fenD mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Tyr
và D-allo-Thr, fenE mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Glu · D-Ala (D-Val), fenA mã
hóa cho enzyme hoạt hóa L-Pro, L-Glu và D-Tyr, fenB mã hóa cho enzyme hoạt hóa
cho amino acid cuối cùng là L-Ile, cuối cùng là gene mã hóa cho enzyme chịu trách
nhiệm tổng hợp chuỗi acid béo.
Chuỗi 81 nucleotide trên phần upstream của fenC có 2 điểm khởi đầu dịch mã và
4 promotor, 2 promotor có cấu trúc tương ứng với promotor được điều hòa bởi yếu tố
điều hòa A, điều này giải thích tại sao fengycin được tổng hợp trong phag tăng trưởng,
2 promotor có cấu trúc tương ứng với yếu tố điều hòa F duy trì sự tổng hợp fengycin
trong phag cân bằng.
Cấu trúc của fengycin, fen operon, trình tự nucleotide của phần upstream của
fenC được trình bày ở Hình 2.7 (phụ lục).
2.5.3.3 Mycosubtilin (19), (34)
Mycosubtilin là lipopeptide có tính kháng sinh thuộc họ iturin. Mycosubtilin có
cấu tạo là một chuỗi β-amino acid béo có chiều dài từ 14-17 C liên kết với 1
heptapeptide mạch vòng có trình tự amino acid là Asn-DTyr-DAsn-Gln-Pro-DSer-Asn.
Các lipopeptide thuộc họ iturin có tính đối kháng mạnh với nấm nhưng có tác động rất
hạn chế với vi khuẩn, trong cấu tạo của chuỗi heptapeptide có DTyr ở amino acid thứ 2
đồng thời có thêm 2 amino acid có cấu hình D ở vị trí 3 và 6. Cấu trúc của
mycosubtilin được trình bày ở Hình 2.8A (phụ lục).
Operon của mycosubtilin bao gồm các gene fenF mã hóa cho protein FenF (45,2
kDa) có hoạt tính malonyl-CoA transacylases, mycA mã hóa cho protein MycA (449,3
kDa) trong cấu tạo của MycA có 2 modul chịu trách nhiệm hoạt hóa Asn và tổng hợp
chuỗi acid béo. Trong modul chịu trách nhiệm tổng hợp acid béo được chia thành
nhiều domain mỗi domain thực hiện một bước chuyên biệt trong quá trình tổng hợp
acid béo, thứ tự sắp xếp của các domain này là AL (acyl-CoA ligase), ACP (acyl
carrier protein), KS (β -keto acyl synthetase), AMT (amino transferase). Tiếp theo là
gene mycB mã hóa cho protein MycB (612,3 kDa) chịu trách nhiệm hoạt hóa 4 amino
acid là DTyr, DAsn, Glu, Pro. Gene cuối cùng trong operon là mycC mã hóa cho MycC
(297.9 kDa) hoạt hóa cho 2 amino acid cuối cùng là DSer và Asn. Cấu trúc của
Mycosubtilin operon được trình bày chi tiết ở Hình 2.8B (phụ lục).
Khác với sự tổng hợp của surfactin, acid béo của mycosubtilin được tổng hợp
kèm với quá trình tổng hợp chuỗi peptide. Acid béo được tổng hợp trên 1 modul của
MycA sau khi tổng hợp, acid béo được gắn nhóm amino vào vị trí β, modul còn lại
hoạt hóa Asn và chuyển vào domain T, sau đó liên kết este được tạo ra giữa acid béo
với gốc amine tự do của Asn. Qúa trình tổng hợp chuỗi peptide xãy ra tương tự với
quá trình tổng hợp của surfactin. Các bước của quá trình tổng hợp acid béo, gắn gốc
amine, tạo liên kết este được trình bày chi tiết ở Hình 2.8C (phụ lục).
2.5.3.4 Bacilysocin (17)
Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, được tổng
hợp khi bắt đầu phag cân bằng sau đó thì giảm dần. Bacilysocin là kháng sinh có bản
chất phospholipid được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis. Cấu trúc của
bacilysocin là 1-(12-methyltetradecanoyl)-3-phosphoglyceroglycerol được thể hiện ở
hình bên dưới.
Bacilysocin được tổng hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol, là một
phospholipid chủ yếu của Bacillus subtilis. Quá trình chuyển phosphatidylglycerol
thành bacilysocin được thực hiện bởi enzyme lysophospholypase được mã hóa bởi
gene ytpA. Quá trình tổng hợp bacilysocin được thể hiện ở Hình 2.9 (phụ lục).

MỤC LỤC
Trang tựa
Lời cảm tạ . i
Tóm tắt . ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt . iv
Danh sách các hình v
Danh sách các bảng . vi
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. E. coli gây bệnh tiêu chảy . 3
2.2. Enterotoxigenic E. coli 4
2.2.1. Độc tố nhạy nhiệt LT 4
2.2.1.1. Cấu tạo của LT-1 4
2.2.1.2. Cơ chế tác động của độc tố LT-1 . 4
2.2.2. Độc tố kháng nhiệt 5
2.2.2.1. Độc tố kháng nhiệt STa 5
2.2.2.2. Độc tố kháng nhiệt STb 6
2.2.3. Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC . 7
2.3. Chế phẩm sinh học 9
2.3.1. Định nghĩa . 9
2.3.2. Cơ chế tác động 9
2.3.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học 9
2.3.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học 10
2.3.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10
2.4. Bacillus subtilis . 11
2.4.1. Đặc điểm phân loại 11
2.4.2. Đặc điểm hình thái 11
2.5. Kháng sinh được tổng hợp bởi Bacillus subtilis 13
2.5.1. Giới thiệu 13
2.5.2. Peptide antibiotic được tổng hợp bằng ribosome . 14
2.5.2.1. Subtilin . 14
2.5.2.2. Subtilosin 15
2.5.2.3. Sublancin 16
2.5.2.4. TasA . 16
2.5.3. Peptide antibiotic không được tổng hợp bằng ribosome . 18
2.5.3.1. Surfactin . 17
2.5.3.2. Fengycin . 19
2.5.3.3. Mycosubtilin . 29
2.5.3.4. Bacilysocin . 20
3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 22
3.1.1. Thời gian . 22
3.1.2. Địa điểm 22
3.2. Vật liệu thí nghiệm . 22
3.2.1. Mẫu thí nghiệm . 22
3.2.2. Hóa chất . 22
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 22
3.3. Phương pháp nghiên cứu . 22
3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo 22
3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa 23
3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên môi trường TSA . 24
3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên môi trường TSB 24
3.3.5. Thử kháng sinh đồ . 24
3.3.6. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trường thạch tinh bột 1% . 24
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 25
4.1. Kết quả 25
4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo 25
4.1.2. Kết quả thử đối kháng với E. coli trên môi trường TSA . 27
4.1.3. Kết quả đối kháng trên môi trường TSB . 29
4.1.4. Kết quả thử kháng sinh đồ . 30
4.1.5. Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột . 32
4.2. Thảo luận 32
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33
5.1. Kết luận . 33
5.2. Đề nghị 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 34
PHỤ LỤC 39