Thạc Sĩ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng

LUẬN ÁN TIẾN TIẾN SĨ VI SINH HỌC
NĂM 2012

MỤC LỤC
Trang
CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU – TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
.1. Tính cấp thiết của đề tài . 1
.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu . 3
.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu . 4
.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 4
.5. Những đóng góp của luận án 5
.6. Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 6
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cố định đạm sinh học . 7
2.1.1. Khái quát về cố định đạm sinh học 7
2.1.2. Chu trình nitơ 8
2.1.3. Vi khuẩn cố định đạm sống tự do . 10
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas 11
2.2.1. Đặc điểm của Pseudomonas . 11
2.2.2. Phân loại Pseudomonas 13
2.2.3. Những loài Pseudomonas có khả năng cố định đạm 15
2.2.4. Phân lập và xác định Pseudomonas . 16
2.3. Cơ chế cố định đạm của Pseudomonas 17
viii
2.3.1. Enzyme nitrogenase . 17
2.3.2. Bộ gen của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp nitrogenase . 20
2.3.3. Cơ chế cố định đạm 24
2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm 25
2.4. Ứng dụng cố định đạm của Pseudomonas 28
2.4.1. Một số ứng dụng 28
2.4.2. Triển vọng ứng dụng Pseudomonas trong tương lai 30
2.5. Vai trò của đạm đối với cây lúa 31
CHƯƠNG III: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu . 33
3.2. Phương tiện nghiên cứu . 33
3.2.1. Vật liệu . 33
3.2.2. Dụng cụ 34
3.2.3. Thiết bị . 34
3.2.4. Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn . 35
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Thu mẫu đất vùng rễ lúa 38
3.3.2. Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ đất vùng rễ lúa 38
3.3.3. Xác định khả năng cố định đạm (in-vitro) của vi khuẩn . 40
3.3.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm . 40
3.3.3.2. Đo hàm lượng NH4
+ bằng phương pháp Phenol – Nitroprusside 41
3.3.3.3. Thử hoạt tính nitrogenase bằng phương pháp khử acetylen (ARA) . 42
3.3.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử . 43
3.3.4.1. Tách chiết DNA (Neumann et al., 1992) 43
3.3.4.2. Khuếch đại DNA 45
3.3.4.3. Điện di các sản phẩm PCR . 46
3.3.4.4. Chụp hình gel điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR 46
3.3.4.5. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI . 47
ix
3.3.5. Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học của các dòng vi khuẩn
với cây lúa cao sản . 47
3.3.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn lên cây lúa trồng trong ống nghiệm 47
3.3.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trồng trong chậu 49
3.3.5.3. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng 50
3.3.6. Khảo sát mật số vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường lỏng 51
3.3.7. Thống kê, xử lý và phân tích số liệu 52
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu mẫu đất vùng rễ lúa 53
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm . 53
4.2.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập 53
4.2.2. Đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn . 54
4.3. Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của vi khuẩn . 56
4.3.1. Khả năng tổng hợp NH4
+ . 56
4.3.2. Hoạt tính nitrogenase 60
4.4. Kiểm tra vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử . 63
4.4.1. Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR . 63
4.4.2. Giải trình tự DNA và so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI 65
4.5. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản 72
4.5.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn với cây lúa trồng trong ống nghiệm . 72
4.5.2. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa trong chậu . 73
4.5.3. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn với cây lúa ngoài đồng 77
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận . 87
5.2. Đề nghị 88
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO


CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU - TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI
.1. Tính cấp thiết của đề tài
Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích gần 4 triệu ha, trong đó có 1,7 triệu ha đất nông nghiệp được sử dụng để trồng lúa với diện tích canh tác lúa hàng năm lên đến 3,9 triệu ha (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008). Phân bón nói chung và phân đạm hoá học nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc gia tăng năng suất cây trồng. Để đảm bảo năng suất, nông dân đã sử dụng rất nhiều phân bón nhưng hiện nay giá cả
phân bón hóa học ngày càng tăng cao làm tăng giá thành sản xuất và giảm hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp. Sự lạm dụng phân đạm hóa học sẽ dẫn đến chi phí cao, đồng thời cũng sẽ dẫn đến những hậu quả như thay đổi lý, hóa tính của đất, giảm độ phì, mất cân bằng sinh thái . gây ảnh hưởng tiêu cực lên hệ sinh thái nên không đảm bảo thân thiện với môi trường canh tác trong nông nghiệp (Kannaiyan, 1999). Theo Võ Minh Kha (2003), cây lúa hấp thu chỉ khoảng 50-60% lượng đạm được bón vào trong đất. Số còn lại sẽ được lưu tồn trong đất hoặc bị rửa trôi gây hưởng đến môi trường nước. Bón quá nhiều phân đạm hóa học cho cây trồng đã góp phần dẫn đến chi phí sản xuất cao, hiệu quả kinh tế thấp, đồng thời không đảm bảo cho một hệ sinh thái phát triển bền vững.
Để khắc phục những tác hại do sử dụng quá nhiều phân đạm hóa học thì việc sử dụng phân đạm sinh học có chứa các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm (BNF: biological nitrogen fixation) là một trong những biện pháp có hiệu quả mà không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng đồng thời vẫn tăng năng suất nông sản. Việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn cố định đạm sinh học đã và đang là những đề tài được nghiên cứu rộng rãi khắp thế giới. Những vi khuẩn cố định đạm đã được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng như vi khuẩnRhizobium (Keyser và ctv., 1982; Scholla và Elkan, 1984); Bradyrhizobium cố định đạm với cây họ đậu (Elkan, 1992; Dowdlé và Bohlool, 1987; Buendia-Clavaria và ctv., 1994); vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và các chất dinh dưỡng khác (Bilal và ctv., 1990; Seshadri và ctv., 2000; Somers và ctv., 2005; Lăng Ngọc Dậu và ctv., 2007), loài Azospirillum lipoferum cũng đã được phân lập từ cây lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2007); vi khuẩn
Azotobacter có khả năng cố định đạm (Döbereiner, 1974), như loài Azotobacter paspali là loài vi khuẩn nội sinh đặc hiệu cho cây cỏ Paspalum notatumvà khoai lang (Döbereiner, 1976); vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có một số đặc tính như cố định đạm, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng ở thực vật (phytohormone) như auxin và gibberellin, làm giảm độ pH môi trường để hòa tan lân khó tan (Bastian và
ctv., 1998; Muthukumarasamy và ctv., 2002a; Tejera và ctv., 2003; Madhaiyan và ctv., 2004), chúng thường hiện diện ở đất quanh rễ cây cà phê, khóm, lúa, khoai lang (Jimenaz-Salgalo và ctv., 1997; Hernandez và ctv., 2000; Muthukumarasamy và ctv., 2002b) đồng thời cũng xác định được nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định đạm mạnh mẽ làm tăng sản lượng mía đường, khóm, khoai lang (Prabudoss và Stella,
2009); vi khuẩn Burkholderia có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần với những cây họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin và ctv., 2001), cộng sinh với nhiều loại cây trồng giúp cố định đạm và kích thích sự tăng trưởng khi chúng hiện diện ở đất quanh vùng rễ và trong rễ của một số loại cây trồng như bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella và ctv., 2003; Chen và ctv., 2006), khóm, chuối (Weber và ctv., 1999) và loài Burkholderia
vietnamiensis đã được tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Gillis và ctv., 1995); Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae(Glickmann et al, 1998; Patten và Glick, 1987; Suzuki và ctv., 2003; Xie và ctv., 1996), hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng hấp thụ như: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas chlororaphis (Cattenlla và ctv., 1999), cố định đạm như Pseudomonas stutzeri (Krotzky và Werner, 1987).
Các loài thuộc giống Pseudomonas có khả năng cố định đạm đã được khẳng định từ lâu (Chan và ctv., 1994), trong đó có Pseudomonas stutzeri(Krotzky và Werner, 1987; Vermeiren, 1999). Ngoài ra, các nhà khoa học cũng đã xác định một số loài vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm và giúp tăng năng suất lúa (Gillis và ctv., 1995; Tran Van và ctv., 2000; Nguyễn Ngọc Dũng và ctv., 2000).
Hiện nay, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn cố định đạm sinh học. Việc nghiên cứu ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm hữu hiệu bón cho cây lúa ở đồng bằng sông Cửu Long mang tính cấp thiết nhằm góp phần giảm sử dụng phân đạm hóa học cho cây lúa nhưng vẫn giữ vững năng suất, bảo vệ môi trường và góp phần đảm bảo cho sự phát triển nông nghiệp bền vững trong khu vực. Do đó, đề tài“Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas spp. bón cho cây lúa cao sản vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện nhằm nhận diện và xác định được những dòng Pseudomonas spp. có khả năng cố định đạm hữu hiệu trên cây lúa cao sản.
.2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chính: Chọn lọc được một số dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. mang gen nif có khả năng cố định đạm hữu hiệu, cung cấp 25-50% nhu cầu đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa cao sản.
- Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tách ròng các dòng Pseudomonas bản địa có trong đất vùng rễ lúa ở đồng bằng sông Cửu Long làm nguồn vi khuẩn cố định đạm với cây lúa cao sản; (2) Khảo sát đặc điểm, khả năng cố định đạm sinh học và nhận diện vi khuẩn Pseudomonas trên các mức độ hình thái, hóa sinh và sinh học phân tử (DNA); (3) Đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn với cây lúa cao sản ở mức độ in-vitro cho đến nhà lưới và ngoài đồng ruộng.