Luận Văn Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ ruột cá Giò nhằm định hướng ứng dụng trong

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ ruột cá Giò nhằm định hướng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản bền vững


MỤC LỤC
LỜI C ẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT . v
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU . 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÁ GIÒ 3
1.1.1. Tên gọi của cá Giò 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái 4
1.1.3. Màu sắc và kích thước . 5
1.1.4. Nơi sống, sinh học vànghề cá . 5
1.1.5. Phân bố . 5
1.1.6. Phân loại theo cấp bậc . 6
1.1.7. Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế . 6
1.2. TÌNH HÌNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN, CÁC VẤN ĐỀ TRONG
NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 7
1.2.1. Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam và thế giới . 7
1.2.2. Các vấn đề phát sinh trong nuôi trồng thủy sản . 13
1.2.2.1. Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 13
1.2.2.2. Các vấn đề môi trường trong nuôi trồng thủy sản . 16
1.3. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 19
1.3.1. Khái niệm vềbacteriocin . 19
iii
1.3.2. Phân loại bacteriocin . 21
1.3.3. Một sốtính chất của bacteriocin 25
1.3.3.1. Phạm vi hoạt động của Bacteriocins . 27
1.3.3.2. Cơ chếhoạt động của Bacteriocin . 27
1.3.3.3. Kiểu hoạt động của Bacteriocin 28
1.3.4. Lợi ích và hạn chếcủa bacteriocin 30
1.3.5. Tình hình nghiên cứu về bacteriocin trên thế giới và Việt Nam . 32
1.3.6. Ứng dụng của bacteriocin 36
1.3.6.1. Ứng dụng của bacteriocin trong kiểm soát vi khuẩn gây bệnh và vi
khuẩn gây hư hỏng thực phẩm. . 36
1.3.6.2. Ứng dụng của bacteriocin trong ngành công nghiệp thủy sản chống
lại sự hư hỏng và dịch bệnh . 38
1.4. TỔNG QUAN VỀ CHẾ PHẨM SINHHỌC (PROBIOTICS) . 42
1.4.1. Thành phần chếphẩm sinh học . 43
1.4.2. Cơ chế tác động của chế phẩm sinh học 44
1.4.3. Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học trên thếgiới và Việt Nam 46
1.4.4. Ứng dụng của chếphẩm sinh học 48
1.4.4.1. Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản . 48
1.4.4.2. Ứng dụng trong xử lý môi trường . 51
1.4.4.3. Một số ứng dụng khác 52
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU . 54
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 54
2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu . 54
2.2.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 55
iv
2.2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn tổng số 55
2.2.2.2. Phương pháp bảo quản và giữ giống . 57
2.2.2.3. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 58
2.2.2.4. Phương pháp xác định đặc điểm sinh học và định danh của chủng vi
khuẩn sinh bacteriocin 61
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 64
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 65
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN TỔNG SỐ TỪ RUỘT CÁ GIÒ . 65
3.2. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH
BACTERIOCIN 68
3.2.1. Kết quả tuyển chọn sơ bộ các chủng vi khuẩn biểnsinh bacteriocin 68
3.2.2. Kết quảkiểm tra bản chất protein của dịch bacteriocin thô với enzym
protease K 72
3.3. MỘT SỐĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI
KHUẨN SINH BACTERIOCIN . 73
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 80
PHỤ LỤC 82


MỞ ĐẦU
Việt Nam có bờbiển dài hơn 3.260 km, với diện tích vùngbiển rộng hơn 1
triệu km
2
, gấp 3 lần diện tích đất liền. Tính đa dạng sinh học biển được đánh giá là
rất lớn, nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ. Các hướng nghiên cứu được quan tâm
từtrước đến nay thường tậptrung vào sựđa dạng của động vật và tảo biển. Tuy
nhiên, những nghiên cứu cơ bản vềvi khuẩnbiển, nhất là trong tương quan với các
động vật chủ, cũng như tiềm năng ứng dụng trong lĩnhvực nuôi trồng hải sản, còn
rất hạn chế.
Nuôi trồng thủy sảnhiện là một trong những lĩnh vực sản xuất thực phẩm
phát triển mạnh nhất ởnước ta. Tuy nhiên, dịch bệnh thường xuyên xảy ra đã gây
thiệt hại kinh tế hàng triệu đô la Mỹmỗi năm. Trong sốcác tác nhân gây bệnh thì vi
khuẩn điển hình là các loài Vibrio, được coi là một trong những nguyên nhân chính.
Hơn nữa, cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu, những quan ngại đối các vi
khuẩn gây bệnh ngày càng tăng lên, bởi vì ởnhiệt độcao hơn thì khảnăng gây bệnh
và truyền nhiễm cũng tăng theo.
Chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản dường như đã mất hiệu quả do
việc lạm dụng quá mức. Việc sửdụng các chất kháng sinh không chỉlàm tăng khả
năng kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡhệvi sinh bình thường và gây ra hiện tượng
mất cân bằng vi sinhmà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong sản phẩm thủy
sản có hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Vì vậy, các giải pháp thay thế thân thiện
với môi trường như sửdụng vaccine, chất kháng sinh thếhệmới hay probiotic đã
được đềxuất (Corripio-Myar et al., 2007; Smith, 2007). Tuy nhiên, sửdụng vaccine
thường tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân công và gây stress mạnh cho động vật
nuôi. Do vậy, sửdụng các vi khuẩnsinh bacteriocin có thểlà giải pháp thay thế rất
phù hợp với vai trò kép bởi vì bacteriocin sẽlà một chất kháng sinh thếhệmới an
toàn và thân thiện với sức khỏe con người và môi trường, trong khi đó các vi khuẩn
đóng vai trò của probiotic.
Trong nhiều năm qua bacteriocin thường được thu nhận từ vi khuẩnlactic có
nguồn gốc từcác loại thực phẩm nhằm ứng dụng đểkéo dài thời gian bảo quản thực
2
phẩm. Tuy nhiên, để có thể ứng dụng trong phòng trừdịch bệnh cho lĩnh vực nuôi
trồng hải sản, vi khuẩnsinh bacteriocin cần được phân lập từcác sinh vật biển hay
môi trường nước biển đểthích nghi với những thay đổi vềnhiệt độvà độ mặn của
điều kiện nuôi. Vì vậy, các vi khuẩnsống bám ởđộng vật biển có thểlà một nguồn
thích hợp đểphân lập và tuyển chọn các chủng sinh bacteriocin. Hơn nữa, các loài
động vật hải sản địa phương cũng là nguồn mẫu tốt cho việc phát hiện các loài vi
khuẩnmới cùng với các loại bacteriocin mới.
Việc đánh giá đa dạng sinh học của vi khuẩnsinh bacteriocin sẽ góp phần
cung cấp những hiểu biết mới vềđặc điểm sinh lý-sinh thái-tiến hóa của vi sinh vật
biển trong mối tương tác với các động vật chủvà với các vi khuẩnđích gây bệnh.
Hơn nữa, các bacteriocin hay BLIS mới có thểđược ứng dụng làm chất bảo quản
thực phẩm hay làm thuốc phòng trừbệnh vi khuẩn cho người, gia súc, gia cầm hay
động vật biển. Đặc biệt, những ứng dụng tiềm năng từkết quảđềtài trong việc phát
triển chất kháng sinh thếhệmới và probiotic có thểdẫn tới giảm thiểu dịch bệnh
trong nuôi trồng hải sản. Sựthành công của đề tài chắc chắn sẽđóng góp tích cực
vào sự phát triển bền vững của nghềnuôi trồng hải sản và cung cấp cho các ngư dân
địa phương một giải pháp m ới đểgiảm thiểu thiệt hại, nâng cao chất lượng cuộc
sống và bảo vệmôi trường trong khu vực.Việc thực hiện đềtài là rất cấp thiết và
phù hợp cho hoạt động nuôi trồng hải sản trong cả nước, không chỉ ở khía cạnh
khoa học mà còn cảtrong những ứng dụng thực tiễn. Vì vậy chúng tôichọn đề tài
“Phân lập và tuyển chọn vi khuẩnbiển sinh bacteriocin từ ruột cá Giò nhằm định
hướng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản bền vững.”
Nội dung của đề tài:
- Thu mẫu động vật (Cá Giò) tại vùng vịnh Nha Trang –Khánh Hòa
- Phân lập vi khuẩn tổng số từ ruột cá Giò
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩnsinhbacteriocin sống trong ruột cá Giò
- Thử hoạt tính bacteriocincủa chủng vi khuẩnsống trong ruột cá Giò
- Xác định đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩnsinh bacteriocin


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUANVỀ CÁ GIÒ
1.1.1. Tên gọicủa cá Giò
Cá Giòlà tên gọi địa phương. Còn tên khoa học theo tiếng Latinh của loài cá
Giò nghiên cứu là Siganus canaliculatus.Loài cá Giò này cũng có tên gọi khác là cá
Dìa.
Chúng thuộc về họ cá Giò Siganidae, họ này theo Fishbase có hai chi và 25
loài. Chúng sống ở vùng Ấn độ –Thái Bình Dương và Biển Địa Trung Hải.
Bảng 1.1. Một số loài cá Giòvàmôitrường sống của chúng
Nguồn[4]
Trong những loài cá Giò trên thì loài cá Giò chấm trắng (Siganus
canaliculatus)được chọn để nghiên cứu trong đề tài này.
Loài Môi trường sống
S. argenteus Cá con: bãi cỏ và rạn san hô
Cá trưởng thành: vùng nước mở
S. canaliculatus Cá con: bãi cỏ; rừng ngập mặn
Cá trưởng thành: chủ yếusống ở các bãi cỏ, ngoài ra sống ở rạn
san hô và rừng ngập mặn
S. corralinus Rạn san hô
S. fuscescens Rạn san hô, thảm thực vật dưới đáy của vùng nước nông, nước
ven bờ
S. guttatus Cá con: Trong các rễ cây ở vùng bóng của rừng ngập mặn, vịnh
nông, cửa sông
Cá trưởng thành: ven biển nhưng trước và sau cửa sông
S. javus Biển, vùng nước lợ, nước ngọt, có thể ở cửa sông, hồ và bến cảng
S. lineatus Cá con: rừng ngập mặn, dọc theo bờ các bến tàu
Cá trưởng thành: rạn san hô, bãi cỏ, dọc theo bờ các bến tàu
S. luridus Các rạn san hô ngầm
S. punctatus Các rạn san hô ngầm
S. puellus Các rạn san hô ngầm, vùng cỏ biển
S. rivulatus Vùng nước nông ở cảng, ở dưới bãi cát ở các hồ đá
S. vermiculatus Rừng ngập mặn
4
Hình 1.1.Cá Giò (Siganus canaliculatus)
1.1.2. Đặcđiểm hình thái
Cá Giòcócơthể rất nhỏ (8 cm hoặc nhỏ hơn) tới rất lớn (15 cm). Chúng có
gai ở vây có thể chích và có các tuyến chứa chất độc. Những gai này có thể thấy ở
vây lưng, vây ngực và vây hậu môn. Vết chích có thể gây đau nhưng không gây
chết người. Nó được đặt tên “rabbitfish”vì mũi nó giống như thỏ, hoặc có thể do
thói quen ăn rong biển của nó. Nó cũng được đặt tên “spinefoot”theo các gai trên
vây ngực, một đặc điểm độc nhất của loài này.
Cá có thân dẹt, thon vừa, chiều cao thân 2,3 –2,8 lần chiều dài chuẩn. Đầu
hõm ít nhiều đến phía trên mắt, mõm nhọn chứ không tròn, trước mũi của cá con có
nắp dài, càng lớn càng ngắn đầu và hoàn toàn thoái hóa ở cá lớn, nắp mũi che chưa
tới nửa sau của mũi ở các loài có chiều dài chuẩn hơn 12 cm. Trước vây lưng có
một gai hướng về trước, gai IV –VII của vây lưng dài nhất, dài hơn gai cuối cùng
1,7 –2,2 lần, gai cuối cùng của vây hậu môn ngắn hơn gai vây hậu môn dài nhất
(thường là gai III) 1,2 –1,5 lần. Phần mềm của vây lưng và vây hậu môn thấp, tia
dài nhất của vây lưng ngắn hơn 0,7 –1 lần so với gai dài nhất của vây lưng. Vây
đuôi gần như lõm ở rìa đối với các loài có chiều dài chuẩn nhỏ hơn 10cm. Loài cá
này có vảy nhỏ, má không có vảy, hoặc có ít hoặc có nhiều vảy li ti, có 16 – 26dãy
vảy giữa đường bên và gốc các gai vây lưng chính.
5
1.1.3. Màu sắcvà kíchthước
Màu sắc của cá Giò hay biến đổi, nhất là do ảnh hưởng của trạng tháimôi
trường sống. Màu cơ bản là xám bạc ở trênlưngchuyển dần sang bạc ở dướibụng,
trên gáy và mặt trên của đầu có vệt màu xanh lá cây, trêngáy và thân có rất nhiều
(100 - 200) đốm màu xanh ngọc chuyển dần sang trắng. Các đốm này ở mặt dưới
thì to bằng que diêm, ở trên đường bên thì nhỏ hơn và ở trên gáy chỉ to bằng đầu
ghim.
Chiều dài lớn nhất khoảng 25 cm, thường là 20 cm.
1.1.4. Nơi sống, sinh học và nghề cá
Cá Giòsống ở vùng nước ven bờ cạn có độ sâu 50 m. Loài này chịu được
nước đục, sống ở vùng cửa sông, nhất là quanh những tầng lớp rong biển và cũng có
ở những vùng nước sâu, sạch cáchbờ biển vài km.
Cá con sống thành đàn rất lớn ở những vịnh cạn và trên những lớp rạn san
hô, càng lớn thì đàn cá nhỏ dần, chia thành nhóm khoảng 20 cá thể trưởng thành.
Vào khoảng thời kỳ sinh sản thìxuất hiện những đàn lớn hơn. Cá Giòăn tảo đáy
biển hoặc ít hơn là tảo biển nước cạn.
1.1.5. Phân bố
Trên Thế giới: Ấn Độ - Thái Bình D ương, vịnh Ba Tư, vịnh Oman, phía
Nam Trung Quốc, Philippines, Indonesia, Nhật Bản, Đài Loan, Tây Úc .
Ở Việt Nam: ở Việt Nam cá phân bố ở khắp các vùng biển ven bờ.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1]. Đa dạng sinh học, khảnăng sinh bacteriocin và tính chất probiotic của hệvi
khuẩn lactic đường tiêu hóa của động vật (gà), Đềtài Khoa học cơ bản 2004-2005,
Viện Công nghệsinh học Hà Nội, Mã số: 62 05 04.
[2].Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh, 2004. Một sốđặc tính của bacteriocin
sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Báo cáo Khoa học năm 2004, Viện
Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
[3].Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2008). Thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm.
Nhà xuất bản đại học Quốc gia thành phốHồChí Minh, thành phốHồChí Minh.
[4]. Nguyễn Duy Chinh. Tổng quan nguồn lợi thủy sản, chiến lược và chính sách
phát triển ngành thủy sản Việt Nam. Hà Nội, 2008.
[5]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phạm Thị Trân Châu, 1972. Một
số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, Nxb KH & KT, Hà Nội.
[6]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phạm Thị Trân Châu, 1976. Một
số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 2, Nxb KH & KT, Hà Nội.
[7]. Nguyễn Lân Dũng,Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phạm Thị Trân Châu,1978. Một
số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 3. Nxb KH & KT, Hà Nội.
[8]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Tỵ (2005). Vi sinh vật
học. Nxb KH & KT, Hà Nội.
[9]. Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng và Huỳnh Lê Tâm (2004). Sổ tay kiểm
nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
[10]. Nguyễn Thị Bích Lân, 2011. Nghiên cứu phân lập một số chủng VKcó hoạt
tính protease sống bám trên cá chim vây vàng. Đồ án tốt nghiệp, Đại học Nha
Trang.
[11]. Nguyễn Phong Hải (Đại Học Nha Trang, Tư Vấn IMOLA), Stefano Carboni
(Đại Học Bách Khoa Marche, Tư Vấn IMOLA), Nhóm Khảo Sát Thuộc Chi Cục
Khai Thác Và Quản Lí Nguồn Lợi Thủy Sản Thừa Thiên Huế. Phân Loại Cá ỞPhá
Tam Giang Cầu Hai I.
81
[12]. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích VSV trong nước, thực phẩm
và mỹ phẩm. Nxb Giáo dục, Hà Nội.
[13]. Tăng Thị Chính, Viện Công nghệ môi trường, Viện KH&CN Việt Nam.
Nghiên cứu, sản xuất probiotics và ứng dụng chúngđể xử lý ô nhiễm môi trường.
[14]. Tổng cục Thủy sản -BộNông nghiệp và Phát triển nông thôn. Hoạt động bảo
vệ môi trường, lĩnh vực NTTSgiai đoạn 2006-2010.
Tài liệu tiếng Anh
[15]. Cotter PD, HillC, Ross PR, 2005. Bacteriocins: developing innate immunity
for food. Nat Rev Microbiol, 3(10):777-788.
[16]. Chen H, Hoover DG, 2003. Bacteriocins and their food applications. Comp
Rev Food Sci Food Safety, 2: 82-100.
[17]. Das S, Ward L, Burke C, 2008. Prospects of using marine actinobacteria as
probiotics in aquaculture. Appl Microbiol Biotechnol, 81: 419-429.
[18]. Desriac F, D Defer, N Bourgougnon, B Brillet, P Le Chevalier and Y Fleury,
2010. Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare:
Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic. Mar Drugs,
8:1153-1177.
[19]. M.N DuRay. Biology and Culture of Siganids. Aquaculture department
southeast asian fisheries development center, April, 1998.
[20]. Nguyen Van Duy (2011): Marine bacteriocinas a new drug for aquaculture
health. Proceedings of the International Conference of Marine Biotechnology and
Environment, Nha Trang 25/02/2011.
[21]. Suphan Bakkal, Sandra M. Robinson and Margaret A. Riley University of
Massachusetts Amherst USA. Bacteriocins of Aquatic Microorganisms and Their
Potential Applications in the Seafood Industry.