Tiến Sĩ Phân lập và tuyển chọn một số dòng aspergillus niger sinh pectin methylesterase hoạt tính cao

Luận án tiến sĩ năm 2013
Đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG ASPERGILLUS NIGER SINH PECTIN METHYLESTERASE HOẠT TÍNH CAO

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN . ii
TÓM LƯỢC iv
SUMMARY . vi
MỤC LỤC . viii
DANH SÁCH BẢNG xiii
DANH SÁCH HÌNH xv
TỪ VI T TẮT . xix
THUẬT NGỮ . xx
MỞ ĐẦU . 1
1. Tính cấp thiết của đề t i . 1
2. Mục ti u v nội dung nghi n cứu 2
3. Đối tượng v phạm vi nghi n cứu . 3
4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học v thực tiễn của luận án . 3
5. Cách tiếp cận v giả thu ết khoa học 4
6. Kết cấu của luận án 5
Chương 1 T NG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1 Tổng quan về enz me pectin meth lesterase 6
1.1.1 Tổng quan 6
1.1.2 Tính chất sinh lý của PME 6
1.1.3 Kiểu phản ứng của PME 7
1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến động học của enzyme PME 8
1.2 Tầm quan trọng của việc sử dụng PME trong thực tiễn . 10
1.2.1 Các ứng dụng cơ bản . 10
1.2.2 Tổng quan về công nghệ chế biến rau quả và sự biến đổi đặc tính cấu trúc của
rau quả trong quá trình chế biến 12
1.2.3 Vai trò của pectin và PME đối với sự cải thiện đặc tính cấu trúc của thực phẩm
nguồn gốc thực vật . 13
1.3 Vai trò của việc thu nhận PME từ nấm mốc Aspergillus niger đặc hiệu 19
1.3.1 Tầm quan trọng của việc thu nhận PME từ nấm mốc A. niger . 19
1.3.2 Vai trò của cơ chất pectin đối với sự phát triển của nấm mốc sinh tổng hợp
enzyme PME 20
1.3.3 Nguồn nguyên liệu cho quá trình phân lập và tuyển chọn A. niger sinh tổng hợp
PME hoạt tính cao 21
1.4 Tổng quan về nấm Aspergillus niger . 22
1.4.1 Giới thiệu chung 22
1.4.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger 23
1.4.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản . 23
1.4.4 Chuyên luận phân loại Aspergillus niger 24
1.4.5 Định danh Aspergillus niger theo phương pháp truyền thống 24
1.4.6 Định danh nhóm loài Aspergillus b ng phương pháp sinh học phân tử 25
1.5 Phương pháp tu ển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh
tổng hợp PME 26
1.5.1 L ý thuyết chung . 26
1.5.2 Tuyển chọn dòng Aspergillus niger sinh tổng hợp PME theo phương pháp sàng
lọc tự nhiên 27
1.6 Ảnh hưởng của th nh phần môi trường đến quá trình sinh tổng hợp PME . 27
1.6.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh tổng hợp PME 27
1.6.2 Ảnh hưởng của thành phần đa lượng . 29
1.6.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng . 30
1.7 Tác động của phương thức v điều kiện l n men đến hiệu quả sinh tổng hợp
PME . 30
1.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 30
1.7.2 Độ ẩm môi trường . 30
1.7.3 Điều kiện pH ban đầu của môi trường . 31
1.7.4 Ảnh hưởng của thời gian ủ 32
1.7.5 Ảnh hưởng của phương thức lên men đến quá trình tổng hợp PME . 33
1.8 Các ếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận PME từ canh trường bề mặt 34
1.9 Các biện pháp tinh sạch PME kỹ thuật 35
1.9.1 Tầm quan trọng của chế phẩm enzyme kỹ thuật trong công nghệ thực phẩm 36
1.9.2 Tinh sạch sơ bộ PME b ng phương pháp kết tủa 37
1.9.3 Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme kỹ thuật . 38
1.10 Qu hoạch thực nghiệm xác định điều kiện l n men thích hợp bằng
phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 38
1.11 Tình hình nghi n cứu trong v ngo i nước về lĩnh vực phân lập, tu ển
chọn v sinh tổng hợp PME 39
Chương 2 PHƯƠNG TIỆN & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 45
2.1 Phương tiện nghi n cứu 45
2.1.1 Địa điểm, thời gian 45
2.1.2 Thiết bị, hoá chất . 45
2.2 Phương pháp nghi n cứu 47
2.2.1 Chuẩn bị mẫu . 47
2.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc 48
2.2.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 50
2.3 Nội dung nghi n cứu . 52
2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát . 52
2.3.2 Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu cho quá
trình sinh tổng hợp PME 54
2.3.3 Nội dung 2: Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rắn sinh tổng
hợp PME . 60
2.3.4 Nội dung 3: Tinh sạch sơ bộ và xác định đặc điểm của PME từ A. niger . 71
2.3.5 Nội dung 4: Ứng dụng chế phẩm PME từ A. niger trong cải thiện đặc tính cấu
trúc rau quả 77
Chương 3 K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 81
3.1 Phân lập v xác định đặc điểm hình thái các dòng nấm có đặc tính giống A.
niger từ vỏ các loại quả gi u pectin 81
3.1.1 Kết quả phân lập các dòng nấm đen thuộc nhóm Aspergillus từ vỏ các loại quả
giàu pectin . 81
3.1.2 Định loại các dòng vừa phân lập dựa trên đặc điểm đại thể của khuẩn lạc . 83
3.1.3 Đặc điểm của bào tử đính và bộ máy mang bào tử của các dòng nấm mốc phân
lập . 85
3.2 Tu ển chọn dòng nấm mốc đặc hiệu đối với PME . 88
3.2.1 Đánh giá khả năng sinh pectinase của các dòng nấm đã được phân lập . 88
3.2.2 Tuyển chọn dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao . 92
3.2.3 Khả năng kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận PME 94
3.2.4 Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng So2 và R
1
đặc hiệu theo các tỷ lệ khác
nhau đến hiệu quả sinh tổng hợp PME hoạt tính cao 96
3.3 Bước đầu định danh một số dòng A. niger đã phân lập bằng kỹ thuật sinh
học phân tử . 98
3.4 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp PME từ
2 dòng A. niger R1
và So
2
. 100
3.4.1 Xác định thành phần cơ bản của cơ chất lên men . 100
3.4.2 Đánh giá tác động của thành phần cơ chất đến hoạt tính PME thu nhận từ quá
trình lên men SSF của hai dòng nấm mốc A. niger R1
và So
2
. 102
3.4.3 Vai trò của việc bổ sung khoáng đến khả năng tổng hợp PME từ A. niger 104
3.4.4 Tác động của nguồn nitrogen bổ sung đến hiệu quả thu nhận PME từ quá trình
lên men SSF dòng A. niger So2 và R
1
107
3.5 Tác động của một số điều kiện l n men đến hiệu quả thu nhận PME từ
A. niger trong quá trình nuôi cấ SSF . 109
3.5.1 Ảnh hưởng của loại dung dịch đệm sử dụng trong điều chỉnh độ ẩm và pH ban
đầu của môi trường lên men đến hiệu quả sinh tổng hợp PME . 109
3.5.2 Sự thay đổi hoạt tính PME và thành phần cơ chất của môi trường nuôi cấy theo
thời gian ủ . 111
3.5.3 Sự tương tác giữa pH, độ ẩm ban đầu của môi trường, tỷ lệ huyền phù bào tử
nấm và nhiệt độ ủ đến quá trình sinh tổng hợp PME từ A. niger 113
3.6 Ảnh hưởng của điều kiện l trích đến hiệu quả thu nhận PME sau quá trình
lên men SSF 120
3.6.1 Ảnh hưởng của việc thay đổi giá trị pH dung dịch đệm đến hiệu quả ly trích
PME . 120
3.6.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch ly trích và canh trường bề mặt sau khi lên men
đến hiệu quả ly trích PME từ nấm mốc A. niger . 122
3.6.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả ly trích PME . 124
3.6.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ ổn định của dịch trích PME thô 126
3.7 Tinh sạch v xác định đặc điểm của PME được sinh tổng hợp từ tổ hợp
A. niger So2 và R1 129
3.7.1 Ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa PME từ
A. niger . 129
3.7.2 Tinh sạch sơ bộ PME từ A. niger b ng phương pháp lọc màng 135
3.7.3 Một số đặc điểm cơ bản của chế phẩm PME kỹ thuật thu nhận từ A. niger . 137
3.8 Khả năng ứng dụng của chế phẩm PME kỹ thuật thu nhận từ A. niger So2
và R
1
đến khả năng cải thiện cấu trúc rau quả . 146
3.8.1 Đối với sản phẩm khóm lạnh đông 146
3.8.2 Tác động của PME đến sự cải thiện cấu trúc dưa leo muối chua 151
K T LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 155
1. Kết luận 155
2. Đề nghị . 156
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 157
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 177
PHỤ LỤC 1 MÔI TRƯỜNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN NẤM MỐC, CÁC
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH . xxi
PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ K T QUẢ KHẢO SÁT . xli
PHỤ LỤC 3 K T QUẢ THỐNG KÊ lxiii
PHỤ LỤC 4 MỘT SỐ HÌNH ẢNH cxv

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần pectin và mức độ ester hóa của pectin ở một số loại trái cây 21
Bảng 1.2: Các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào
nấm mốc Aspergillus sp. 28
Bảng 2.1: Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc . 49
Bảng 2.2: Công thức tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch PME 50
Bảng 2.3: Giá trị mã hóa và giá trị thực của các nhân tố tương tác đến hiệu quả sinh tổng
hợp PME (U/g) 66
Bảng 2.4: Các nghiệm thức khảo sát theo phương pháp bề mặt đáp ứng, áp dụng thiết kế
trung tâm phức hợp 67
Bảng 3.1: Số dòng nấm mốc được phân lập từ vỏ các loại quả giàu pectin . 82
Bảng 3.2: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme pectinase . 89
Bảng 3.3: Kết quả thống kê sự khác biệt đường kính vòng phân giải pectin (D) của các
dòng nấm mốc thuộc nhóm đặc hiệu cao với pectinase . 90
Bảng 3.4: Sự thay đổi đường kính vòng phân giải pectin và hoạt tính PME sinh tổng hợp từ
các dòng nấm mốc đặc hiệu với pectinase . 93
Bảng 3.5: Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng nấm mốc đến hiệu quả thu nhận enzyme
PME . 95
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng R1
và So
2
đến hiệu quả sinh tổng hợp
PME hoạt tính cao 97
Bảng 3.7: Thành phần hóa học cơ bản của các nguồn cơ chất lên men 101
Bảng 3.8: Sự thay đổi hoạt tính PME ở các tỷ lệ kết hợp khác nhau của bã táo ta và vỏ quả
cam/bưởi 102
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ và loại khoáng bổ sung vào môi trường lên men đến sự
thay đổi hoạt tính của PME từ A. niger . 105
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của việc bổ sung kết hợp các loại khoáng vào môi trường nuôi cấy
đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A. niger 107
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của hàm lượng và nguồn nitrogen bổ sung đến hoạt tính PME từ
quá trình sinh tổng hợp A. niger 108
Bảng 3.12: Sự thay đổi hàm lượng pectin, DE, độ ẩm của canh trường sau khi lên men và
pH của dịch trích enzyme sau thời gian nuôi cấy 112
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối với phương trình hồi quy . 114
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch đệm citrate và canh trường sau lên men đến
hiệu quả thu nhận PME 122
Bảng 3.15: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phương pháp kết tủa với (NH4)2SO4 130
Bảng 3.16: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phương pháp kết tủa với NaCl . 131
Bảng 3.17: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phương pháp kết tủa với ethanol 132
Bảng 3.18: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phương pháp kết tủa với aceton 133
Bảng 3.19: So sánh hiệu quả tinh sạch PME b ng các tác nhân khác nhau 134
Bảng 3.20: Hiệu quả tinh sạch PME từ A. niger sau quá trình lọc màng 135
Bảng 3.21: Các thông số động học của quá trình bất hoạt nhiệt PME sinh tổng hợp từ
A. niger . 141
Bảng 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính PME từ A. niger . 142
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2
đến hoạt tính PME từ A. niger 143
Bảng 3.24: Độ cứng tương đối trung bình của khóm do tác động của tiền xử lý với PME
nấm mốc và CaCl
2
theo các phương thức khác nhau 148
Bảng 3.25: Ảnh hưởng của hoạt tính PME nấm mốc bổ sung đến sự thay đổi độ cứng
tương đối và độ DE của khóm đông lạnh 150
Bảng 3.26: Ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý nhiệt (ở 50C) đến sự thay đổi độ ester hóa
pectin và đặc tính cấu trúc dưa leo . 152
Bảng PL1.1: Phân biệt một số giống Aspergillus và Penicillium . xxiv
Bảng PL1.2: Cách pha dung dịch đệm citrate xxix
Bảng PL1.3: Cách pha dung dịch đệm acetate xxix
Bảng PL1.4: Cách pha dung dịch đệm citrate-phosphate xxx
Bảng PL1.5: Bảng tra nồng độ muối (NH
4
)
2SO4
bão hòa bổ sung trong tiến trình kết tủa
enzyme và protein . xxxi
Bảng PL1.6: Chuẩn bị dung dịch đệm CTAB (CTAB buffer) . xxxiv
Bảng PL1.7: Bảng tra lượng đường nghịch chuyển . xxxix
Bảng PL2.1: Hình thái khuẩn lạc của 60 dòng Aspergillus niger đã phân lập trên môi
trường MEA và môi trường CZ . xli
Bảng PL2.2: Đặc tính vi thể của các dòng A. niger phân lập trên môi trường CZ xlv
Bảng PL2.3: Đặc tính vi thể của các dòng A. niger phân lập trên môi trường MEA . xlvii
Bảng PL2.4: Đường kính vòng phân giải pectin (D) của các dòng A. niger . xlix
Bảng PL2.5: Hiệu quả thu nhận PME theo khối lượng cơ chất ly trích khác nhau . lix
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ
Chuyên ngành Vi sinh v t h xv i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME . 6
Hình 1.2: Tác dụng của PME trong quá trình làm trong nước quả 11
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử pectin 14
Hình 1.4: Sơ đồ mô tả các cấp độ cấu trúc của thực phẩm nguồn gốc thực vật 15
Hình 1.5: Mô hình cấu trúc của vách tế bào thực vật bậc cao . 15
Hình 1.6: Sơ đồ biểu diễn các chuyển hóa của pectin dưới tác động của enzyme thủy phân
ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào . 16
Hình 1.7: Hình thái Aspergillus sp. 23
Hình 1.8: Cấu trúc của trình tự mã hoá cho rRNA ở sinh vật nhân thật 25
Hình 1.9: Các phương pháp thu chế phẩm enzyme . 36
Hình 2.1: Nguyên liệu khóm và cách chuẩn bị mẫu thí nghiệm 47
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát . 53
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập và tuyển chọn nấm mốc 54
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 5 – Khả năng kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu đến
hiệu quả thu nhận PME 59
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 8 - Ảnh hưởng của việc kết hợp bã táo và vỏ quả cam/bưởi đến
quá trình sinh tổng hợp PME ở điều kiện lên men SSF 62
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 9a - Ảnh hưởng của từng thành phần khoáng 63
bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính của PME được tổng hợp bởi A. niger 63
Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 13 - Ảnh hưởng tương tác của các điều kiện lên men đến
hiệu quả thu nhận PME 68
Hình 2.8: Sơ đồ kết tủa PME b ng dung dịch muối (NH4
)
2SO4
/NaCl 73
Hình 2.9: Sơ đồ kết tủa PME b ng dung môi hữu cơ 74
Hình 3.1: Mặt trên của mẫu phân lập M3
82
Hình 3.2: Mặt dưới của mẫu phân lập M3
82
Hình 3.3: Hình dạng mặt trên của khuẩn lạc 83
Hình 3.4: Hình dạng mặt dưới của khuẩn lạc . 83
Hình 3.5: Đặc điểm khuẩn lạc của dòng S2 và G
1 khi được cấy 3 điểm trên môi trường CZ
. 84
Hình 3.6: Dòng A. niger đối chứng (Klich, 2002) . 85
Hình 3.7: Dòng nấm mốc H2 trên môi trường MEA . 85
Hình 3.8: Sợi nấm có vách ngăn của dòng So
2 ở vật kính 4X . 86
Hình 3.9: Hình ảnh dòng So2 ở vật kính 4X và 10X . 86
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ
Chuyên ngành Vi sinh v t h xvi i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h
Hình 3.10: Hình ảnh bào tử dưới kính hiển vi của dòng A. niger 86
Hình 3.11: Thể bình còn non (phát triển 1 tầng) dòng So2
87
Hình 3.12: Hai vòng thể bình và bào tử của dòng So
2
. 87
Hình 3.13: Mặt trên vòng phân giải pectin của dòng nấm So2
. 91
Hình 3.14: Mặt dưới vòng phân giải pectin của dòng nấm So
2
. 91
Hình 3.15: Mẫu đối chứng nước 91
Hình 3.16: Mẫu đối chứng A. niger V 91
Hình 3.17: Vòng phân giải pectin trên môi trường pectin - agarose sau 24 giờ ủ ở 37°C và
nhận diện với thuốc thử CTAB 1% . 93
Hình 3.18: Ảnh hưởng của sự kết hợp các dòng nấm mốc khác nhau đến sự thay đổi vòng
phân giải pectin trên môi trường pectin - agarose . 95
Hình 3.19: Phổ điện di của sản phẩm PCR của các mẫu nấm được khuếch đại 98
Hình 3.20: Biểu đồ biểu diễn trình tự của một đoạn RNA gene của 4 mẫu nấm 100
Hình 3.21: Tỷ lệ tương đồng về gene của dòng nấm So2
và dòng A. niger NBL, BR 28s
ribosomal RNA gene hay An03c0110 . 100
Hình 3.22: Đồ thị so sánh ảnh hưởng của các loại khoáng bổ sung tối ưu đối với hiệu quả
gia tăng hoạt tính PME từ A. niger 106
Hình 3.23: Ảnh hưởng của loại dung dịch đệm sử dụng trong điều chỉnh độ ẩm và pH môi
trường lên men đến hoạt tính PME từ quá trình sinh tổng hợp A. niger . 110
Hình 3.24: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt tính PME thu nhận từ A. niger 111
Hình 3.25: Đồ thị tương quan giữa hoạt tính PME xác định thực nghiệm và tính toán theo
phương trình hồi quy . 115
Hình 3.26: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của từng cặp nhân tố đến hiệu quả thu nhận PME
. 116
Hình 3.27: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và
pH môi trường ban đầu đến hoạt tính PME thu nhận 117
Hình 3.28: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương quan của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm
bổ sung và nhiệt độ ủ đến hoạt tính PME thu nhận 117
Hình 3.29: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và
độ ẩm môi trường ban đầu đến hoạt tính PME thu nhận . 117
Hình 3.30: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác của nhiệt độ ủ và pH ban đầu của
môi trường đến hoạt tính PME thu nhận 117
Hình 3.31: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác của pH và độ ẩm ban đầu của môi
trường lên men đến hoạt tính PME thu nhận 118
Hình 3.32: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác giữa nhiệt độ ủ và độ ẩm ban đầu
của môi trường lên men đến hoạt tính PME thu nhận 118
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ
Chuyên ngành Vi sinh v t h xvii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h
Hình 3.33: Ảnh hưởng của pH dung dịch ly trích đến hoạt tính PME 121
Hình 3.34: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ly trích đến hoạt tính PME . 125
Hình 3.35: Sự thay đổi hoạt tính PME thô (A/Ao
) theo thời gian bảo quản 127
ở nhiệt độ lạnh (4°C) 127
Hình 3.36: Sự thay đổi hoạt tính PME thô (A/Ao
) theo thời gian bảo quản 127
ở nhiệt độ lạnh đông (-18°C) . 127
Hình 3.37: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE các mẫu PME từ A. niger . 136
Hình 3.38: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính PME từ A. niger . 137
Hình 3.39: Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng điểm biểu thị sự tương quan giữa
pH và nhiệt độ đến hoạt tính PME từ A. niger 139
Hình 3.40: Phương trình biểu thị sự vô hoạt nhiệt của PME từ A. niger . 140
Hình 3.41: Quy trình tổng hợp chế phẩm PME kỹ thuật từ A. niger . 145
Hình 3.42: Sự thay đổi độ ester hóa của pectin trong khóm do tác động của tiền xử lý với
PME nấm mốc và CaCl2
theo các phương thức khác nhau . 146
Hình 3.43: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ cứng tương đối (H/Ho
) của dưa leo muối chua
theo các tỷ lệ PME và CaCl
2
bổ sung trong dịch chần ở 50C, 30 phút 153
Hình PL1.1: Hình thái đại thể và vi thể A. niger . xxv
Hình PL1.2: Bào tử của A. awamori (trái) và A. foetidus (phải) xxvi
Hình PL1.3: Khuẩn lạc 7 ngày của dòng nấm mốc trên môi trường định loại đặc trưng: A.
foetidus (h, CZ), A. niger (i, MEA) và A. awamori (j, CZ) xxvii
Hình PL2.1: Ảnh hưởng của các chất kìm hãm đến hoạt động của PME nấm mốc . lx
Hình PL2.2: So sánh hiệu quả cải thiện độ cứng của khóm do tác động của quá trình tiền
xử lý với PME ngoại bào có nguồn gốc khác nhau lxii
Hình PL3.1: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hưởng của dòng nấm mốc đến khả năng
thu nhận PME thông qua đường kính vòng phân giải pectin lxviii
Hình PL3.2: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn sự thay đổi hoạt tính PME của các dòng nấm
mốc khác nhau lxx
Hình PL3.3: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hưởng kết hợp 4 dòng nấm mốc đặc hiệu
đến khả năng thu nhận PME thông qua đường kính vòng phân giải pectin . lxxii
Hình PL3.4: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hưởng của sự kết hợp 4 dòng nấm mốc
đặc hiệu đến hoạt tính PME . lxxiv
Hình PL3.5: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ kết hợp R1
và So
2
đến
hiệu quả thu nhận PME dựa trên đường kính vòng phân giải pectin lxxv
Hình PL3.6: Đồ thị Box – Whisker biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ kết hợp R1
và So
2
đến
hoạt tính PME lxxvi
Hình PL4.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu cxv
Hình PL4.2: Một số hình ảnh chuẩn bị cơ chất và lên men SSF sinh tổng hợp PME cxvi
Hình PL4.3: Các mẫu dưa leo muối chua . cxvi
Hình PL4.4: Một số công đoạn tiền xử lý và cải thiện đặc tính cấu trúc khóm đông lạnh
. cxvii
A. Aspergillus
B. Botrytis
bp base pair
BSA Bovine serum albumin
CBB Coomassie Brilliant Blue
cbk căn bản khô
CCD Central composite design (mô hình phức hợp tại tâm)
cfu colony forming unit (mật số bào tử hình thành)
CM–Sepharose Carboxymethyl Sepharose
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
CZ Czapek Dox Agar
DE Degree of esterification (mức độ ester hóa)
DNA Deoxyribonucleic acid
E. Erwinia
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EGCG Epigallocatechin gallate
GalA Galacturonic acid
HG Homogalacturonan
HMP High Methoxyl Pectin (pectin có độ methoxyl hóa cao)
IAA Iodoacetamide
ITS Internal transcribed spacer
kDa Trạng Quỳnhdalton
LMP Low Methoxyl Pectin (pectin có độ methoxyl hóa thấp)
LSU Large subunit (tiểu đơn vị có kích thước lớn)
MEA Malt Extract Agar
MI Methoxyl Index (chỉ số methoxyl)
NCBI National Center for Biotechnology Information
NCKH Nghiên cứu khoa học
PCR Polymerase Chain Reaction
PDA Potato Dextrose Agar
PG Polygalacturonase
pI Isoelectric point (điểm đẳng điện)
PL Pectate lyase
PME Pectin methylesterase
PMEI Pectin methylesterase inhibitor (chất ức chế pectin methylesterase)
QĐ-BGDĐT Quyết định – Bộ Giáo dục và Đào tạo
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
rpm rounds per minute (số vòng trên phút)
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
RSM Response Surface Methodology (phương pháp bề mặt đáp ứng)
SDS–PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SmF Submerged fermentation (lên men bề mặt trên môi trường lỏng)
SSF Solid state fermentation (lên men bề mặt trên môi trường rắn)
SSU Small subunit (tiểu đơn vị kích thước nhỏ)
TSS Total soluble solid (tổng chất khô hòa tan)
v/v volume/volume (tỷ lệ thể tích/thể tích)
v/w volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lượng)
w/w weight/weight (tỷ lệ khối lượng/khối lượng)
U/g Units per weight (gram) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 g cơ chất)
U/mL Units per volume (mL) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 mL cơ chất)
THUẬT NGỮ
Pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger: PME được thu nhận từ quá
trình ly trích sinh khối nấm mốc sau quá trình lên men SSF hay SmF dòng A. niger
ở các điều kiện ủ thích hợp.
PME cà chua: PME được ly trích từ cà chua ở điều kiện thích hợp.

TÓM LƯỢC
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng Aspergillus niger sinh pectin methylesterase
hoạt tính cao” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa
Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ và các phòng thí nghiệm có
liên quan, từ tháng 11.2008 đến tháng 9.2012.
Đề tài được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp và ứng dụng
enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ sự lên men bề mặt trên môi trường
rắn, sử dụng dòng Aspergillus niger (A. niger) đặc hiệu được phân lập và tuyển chọn trong
điều kiện thực tế tại Việt Nam.
Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 60 dòng có đặc tính giống Aspergillus niger từ vỏ
các loại quả giàu pectin phổ biến ở khu vực đồng b ng sông Cửu Long như vỏ cam, bưởi,
chanh, hạnh, táo và sung, sử dụng các môi trường nước trích khoai tây (Potato Dextrose
Agar, PDA), Czapek Dox Agar (CZ) và Malt Extract Agar (MEA). Việc tuyển chọn các
dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp pectinase được thực hiện b ng cách đo đường
kính vòng phân giải pectin cho thấy, tất cả 60 dòng đều có khả năng phân giải pectin, trong
đó 14 dòng nấm đã phân lập có đường kính vòng phân giải lớn hơn 20 mm.
Kết quả sàng lọc các dòng nấm có khả năng sinh tổng hợp PME từ 14 dòng đặc hiệu với
pectinase đã tuyển chọn được 4 dòng có hoạt tính PME thu được cao và ổn định, ký hiệu
T1, N
1
, So
2 và R
1
phân lập từ vỏ táo ta, vỏ quả chanh núm, vỏ cam soàn và bưởi Năm Roi.
Sự kết hợp của 2 dòng R1
và So
2
với tỷ lệ 1:1 được lựa chọn trong nghiên cứu xác định
điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rắn sinh tổng hợp PME có hiệu quả cao nhất. Kỹ
thuật giải trình tự gene 28S rRNA cũng được áp dụng để nhận diện bốn (4) dòng T1, N
1
,
So2 và R
1,
kết quả cho thấy, 4 dòng này đều thuộc A. niger với mức độ đồng hình 99 ư
100%.
Điều kiện lên men rắn sinh tổng hợp PME từ tổ hợp A. niger So2
và R
1
đã được xác định
dựa trên việc khảo sát một số yếu tố đơn lẻ (thành phần cơ chất, dinh dưỡng, tác động của
dung dịch đệm và thời gian ủ) kết hợp với việc tối ưu hóa một số yếu tố chính (pH ban đầu,
độ ẩm môi trường lên men, tỷ lệ bào tử nấm mốc sử dụng và nhiệt độ lên men) theo
phương pháp bề mặt đáp ứng với mô hình phức hợp tại tâm. Điều kiện ly trích, thu nhận
enzyme sau lên men (pH của dung dịch đệm, tỷ lệ dung môi và cơ chất, nhiệt độ và thời
gian ly trích tương ứng) cũng được xác định. Kết quả đã cho thấy hiệu quả của việc tận
dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp là bã táo ta khô và vỏ bưởi Năm Roi tươi làm cơ chất
lên men chính (với tỷ lệ bã táo ta và vỏ bưởi là 1:1 w/w) cho việc thu nhận PME. Quá trình
lên men đạt hiệu quả cao nhất khi môi trường nuôi cấy được điều chỉnh đến độ ẩm 57,4%
b ng dung dịch đệm citrate pH 4,0, có bổ sung 0,1% urea, 0,5% MgCl2
và 0,15% CaCl2
, tỷ
lệ huyền phù bào tử nấm ở mật số 10
5
cfu/mL sử dụng là 16,5% v/w (mL/g). Sau 96 giờ ủ
ở nhiệt độ 35,5°C, PME thô được ly trích ở nhiệt độ 35°C trong thời gian 50 phút b ng
dung dịch đệm citrate pH 3,6, sử dụng tỷ lệ dung dịch đệm và cơ chất là 2:1 v/w (mL/g).
Ước tính hoạt tính PME đạt được ở điều kiện lên men và ly trích tốt nhất là 79,1 U/g cơ
chất.
PME thô thu được sau khi tinh sạch sơ bộ b ng kết tủa với ethanol ở tỷ lệ 3:1 (v/v), thể
hiện ở hoạt tính riêng là 10,02 U/mg
protein
, hiệu suất thu hồi 91,48% và độ tinh sạch tăng
gấp 7,98 lần so với mẫu enzyme thô. Sau khi kết tủa với ethanol, tiến hành lọc màng ở
khoảng phân đoạn 50 kDa thu được PME có hoạt tính riêng đạt 15,63 U/mg
protein,
độ tinh
sạch tăng 12,40 ± 0,89 lần khi so sánh với mẫu enzyme thô. PME từ A. niger có khối
lượng phân tử khoảng 43 kDa, h ng số Km của PME đạt được là 0,6014 mg/mL. Hoạt tính
của PME thu nhận từ A. niger thể hiện cao nhất ở 38 ư 40°C và pH môi trường 5,0. Cả hai
muối CaCl2
và NaCl đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của PME từ A. niger.
Đồng thời, sự bất hoạt nhiệt của PME tuân theo phương trình bậc 1 chuyển đổi một phần
với hệ số góc k tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 50 đến 70°C.
Việc nghiên cứu thử nghiệm trên một vài sản phẩm thực phẩm có cấu trúc không ổn định
cũng đã khẳng định hiệu quả tích cực của chế phẩm PME kỹ thuật từ nấm mốc trong việc
cải thiện độ cứng chắc của sản phẩm sau chế biến, điển hình là khóm lạnh đông và dưa leo
muối chua.

SUMMARY
The thesis “Isolation and screening of Aspergillus niger biosynthesize high activity pectin
methylesterase” was performed in the laboratory of Food Technology Department, College
of Agriculture and Applied Biology, Can Tho University and other laboratories, from
11.2008 to 9.2012.
The thesis was conducted to investigate the biosynthesis process and application of pectin
methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) in solid state fermentation (SSF) of isolated and
selected Aspergillus niger from the practical conditions of Vietnam.
Sixty species which have morphologically similar Aspergillus niger were isolated from the
peels of rich pectin fruits which have been found to be widely in Mekong delta, such as
orange, pomelo, citrus, apple and fig peels on Potato Dextrose Agar (PDA), Czapek Dox
Agar (CZ) and Malt Extract Agar (MEA). To indicate the pectinase activity of the
organisms, diameters of clear zone around colonies on pectin - agar medium were
measured. The result showed that all of sixty isolates have the ability of pectinolytic
activities, in which 14 out of the 60 isolates were able to produce a higher pectinase
activity, based on the average clear zone diameters were larger than 20 mm.
Further screening of PME production of the 14 selected isolates, the maximum PME
production was obtained by 4 isolates (T1, N
1
, So
2
and R1
) which were isolated from the
peels of Ziziphus mauritiana (“tao ta”), Citrus lemon (“chanh num”), Citrus sinensis L.
(“cam soan”) and Citrus maxima (“Nam Roi” pomelo), respectively. The combination of
two isolates of R1
and So
2
with the proportion of 1:1, was conducted to investigate the
suitable conditions for PME biosynthesis by solid state fermentation. In addition, the
identification by sequencing of 28S rRNA gene, revealed that 4 selected isolates T1
, N1
,
So2
and R1
had 99 ư 100% identity to Aspergillus niger.
The optimal conditions of pectin methylesterase biosynthesis from A. niger So2
and
R1
in solid-state fermentation were evaluated, based on the individual factors (substrate
characteristics, nutrients, buffer solutions and incubation time) which influenced to PME
production were investigated. After that, the Response surface methodology (RSM) based
on four-variable central composite design (CCD) can be used to model the correlation of
the fermentation conditions such as inducer concentration, initial pH, incubation
temperature and moisture content of medium to PME activity. Moreover, some extraction
parameters consist of type of solvent, pH, ratio of solvent and fermented solids were
studied. In addition, the best combination of extraction temperature, contact time was also
determined.
Especially, the use of rich pectin of agricultural material in Mekong Delta (mixture of
apple pomace and pomelo peels at the ratio of 1:1 w/w) as a fermentation medium was taken into consideration for the PME production of A. niger in this investigation. With the
addition of 0.1% urea combined with 0.5% MgCl
2
and 0.15% CaCl
2
into media, the
highest PME obtained after 96 hours incubation at a temperature of 35.5°C, pH 4.0
(adjusted by citrate buffer), fermentation temperature and moisture content adjusted
to 57.4% and 16.5% v/w of inducer concentration (10
5
cfu/mL). In addition, citrate buffer
(pH 3.6) at 35°C and 50 min provided the best recovery in order to obtain highest value
of PME. The ratio 2:1 (v/w) of solvent and substrate was determined as an optimal
condition for concentrated enzyme extracts. Maximum production of PME (about 79.1 U/g
of substrate) was recorded under optimum conditions of SSF and extraction.
Ethanol was the appropriate precipitant for PME purification with the optimal ratio of cold
ethanol and crude enzyme 3: 1 (v/v). In this case, specific activity of PME was 10.02
U/mgprotein
, the purification factor achieved 7.98 fold and the PME recovery yield obtained
91.48%. Combined with the cross flow membrane step, the specific activity of PME
reached to 15.63 U/mg
protein
and the purification factor achieved 12.40 ± 0.89 fold in
comparison to the crude enzyme solution. The molecular weight of the enzyme was found
to be 43 kDa and Km was 0.6014 g/L. The activity of the enzyme was stimulated by NaCl
or CaCl
2
. In addition, the optimum temperature and pH of A. niger PME
were 38 ư 40°C and 5.0, respectively. Isothermal inactivation of partial purified
A. niger PME could be described by a fractional – conversion model and the inactivation
rate constants increase with increasing temperatures from 50 to 70°C.
The obtained technical PME enzyme also proved the positive effects to improving of the
texture of frozen pineapples and fermented cucumbers.

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề t i
Ứng dụng enzyme trong chế biến thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác đã và đang là
một trong những vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn. Hiện nay, các
nước phát triển đang áp dụng các chế phẩm enzyme trong sản xuất để tạo ra
những sản phẩm có năng suất và chất lượng cao với giá thành hạ (Saurel, 2003;
Suutarinenn và Autio, 2004; Ngô Tiến Hiển, 2001). Việt Nam là nước giàu tiềm
năng về nông sản, nhu cầu các loại enzyme phục vụ trong chế biến thực phẩm là
rất lớn. Tuy nhiên, ở Việt Nam hoàn toàn không có xưởng sản xuất chế phẩm
enzyme, hàng năm nước ta vẫn phải nhập ngoại một khối lượng lớn những loại
enzyme này (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b).
Pectinase là nhóm enzyme xúc tác cho sự thủy phân các polymer pectin - đang
được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm cũng như xử lý chất thải và
nhiều lĩnh vực khác. Ở Việt Nam, chế phẩm pectinase đã được sử dụng khá phổ
biến và được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Lê Văn Nhương et al.,
1978; Phí Quyết Tiến, 1999; Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọc Hùng, 2008). Tuy
nhiên, đối với lĩnh vực cải thiện đặc tính cấu trúc tế bào rau quả - một hạn chế lớn
về chất lượng của sản phẩm sau chế biến, việc sử dụng hỗn hợp chế phẩm
pectinase không mang lại hiệu quả tích cực. Trong khi đó, pectin methylesterase
(PME, EC 3.1.1.11) – một enzyme thuộc nhóm pectinase đóng vai trò rất quan
trọng (Van Buren, 1979).
PME đã được quan tâm sử dụng và phát triển ở nhiều quốc gia (Saurel, 2003;
Suutarinenn và Autio, 2004) với các mục đích như hạn chế sự phá hủy cấu trúc
của tế bào thực vật, tăng hiệu suất ly trích nước quả và thúc đẩy nhanh quá trình
sấy rau quả (Van Buren, 1979; Sajjaanantakul và Pitifer, 1991). Tuy nhiên, việc
ứng dụng PME trong công nghiệp chế biến các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật
ở Việt Nam vẫn chưa được quan tâm, đồng thời vẫn có sự nhầm lẫn trong hiểu
biết về PME và pectinase. Chính vì thế, việc nghiên cứu có hệ thống sự thu nhận
PME và khả năng ứng dụng thực tiễn của enzyme này trong điều kiện hiện tại của
Việt Nam là vấn đề cần thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.
Bên cạnh PME từ thực vật, nguồn giàu PME và được sử dụng nhiều nhất trong
các chế phẩm pectinase thương mại là các PME từ vi sinh vật (Solis – Pereira et
al.,1993). Nấm mốc được biết đến như nguồn phổ biến nhất cho sản xuất enzyme
này (Taragano et al., 1997, trích dẫn bởi Patil và Dayanand, 2006). Mặc dù vậy,
không phải tất cả nấm mốc đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả
những dòng cùng một giống cũng không có khả năng sinh tổng hợp enzyme với
hoạt tính tương đồng (Nguyễn Đức Lượng, 2004; Parenicova, 2000). Ở Việt Nam,
nghiên cứu tổng hợp các chế phẩm từ dòng Aspergillus nói chung cũng như
A. niger nói riêng mới dừng lại ở nghiên cứu thăm dò, đồng thời chỉ quan tâm đến
khả năng tổng hợp pectinase (Phí Quyết Tiến, 1999; Lê Thị Thanh Hương và
Nguyễn Thùy Châu, 2005). Nghiên cứu thu nhận PME từ dòng nấm mốc có s n
cũng gặp nhiều khó khăn do ngân hàng giống ở Việt Nam chưa phát triển , việc
nhập ngoại không những gây bất lợi về mặt kinh tế mà còn có các khó khăn về
điều kiện môi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme
(Bhalla và Chatanta, 2000). Do đó, vấn đề tuyển chọn dòng A. niger có khả năng
sinh tổng hợp PME hoạt tính cao đòi hỏi nhiều thời gian và công sức nghiên cứu.
Hoạt động của PME được biết đến chủ yếu nhờ vào tác động của enzyme này trên
pectin có độ methoxyl hóa cao (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Bhalla và
Chatanta, 2000). Chính vì thế, các nguồn phụ phẩm giàu pectin không chỉ được sử
dụng như cơ chất cảm ứng cho quá trình lên men sinh tổng hợp PME, mà các
chủng vi sinh vật được phân lập từ nguyên liệu giàu pectin cũng cho thấy tiềm
năng của chúng trong việc thu nhận enzyme này (Lê Thị Thanh Hương và Nguyễn
Thùy Châu, 2005; Pilnik và Voragen, 1993).
Với những ưu điểm mà PME mang lại cho công nghiệp thực phẩm và vai trò quan
trọng của khâu tuyển chọn dòng A. niger trong công nghiệp sản xuất enzyme,
nghiên cứu tổng hợp PME cần được tiến hành một cách cụ thể ngay từ bước đầu
phân lập và tuyển chọn các dòng A. niger đặc hiệu với PME đến việc nghiên cứu
xác định điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme phù hợp, ứng dụng hiệu quả
trong lĩnh vực cải thiện cấu trúc rau quả.
2. Mục ti u v nội dung nghi n cứu
i. Mụ ti u hính
Nghiên cứu sinh tổng hợp và ứng dụng PME từ quá trình lên men bề mặt
trên môi trường rắn dòng A. niger đặc hiệu được phân lập và tuyển chọn từ các
loại vỏ quả giàu pectin ở đồng b ng sông Cửu Long.
ii. Mụ ti u ụ th
(1) Phân lập, tách ròng và xác định đặc điểm các dòng A. niger bản địa từ các
vỏ quả giàu pectin phổ biến tại đồng b ng sông Cửu Long, làm nguồn nấm
mốc sử dụng cho quá trình sinh tổng hợp PME.
(2) Tuyển chọn các dòng A. niger đặc hiệu, phù hợp cho quá trình lên men sinh
tổng hợp PME đạt hiệu quả cao.
(3) Xác định điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME,
đồng thời xác định đặc điểm của enzyme này.
(4) Đánh giá hiệu quả sử dụng thực tế của PME ở điều kiện phòng thí nghiệm.
iii. Nội dung nghi n ứu
Nghiên cứu được thực hiện với 4 nội dung chính:
Phần 1: Phân lập và tuyển chọn các dòng A. niger từ vỏ quả giàu pectin có khả
năng sinh tổng hợp PME (mục tiêu 1 và 2).
Phần 2: Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bề mặt trên môi
trường rắn sinh tổng hợp PME từ A. niger (mục tiêu 3).
Phần 3: Tinh sạch sơ bộ và xác định đặc điểm của PME thu nhận từ quá trình lên
men A. niger đặc hiệu (mục tiêu 3).
Phần 4: Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm PME vào việc cải thiện cấu trúc hai sản
phẩm điển hình là khóm đông lạnh và dưa leo muối chua (mục tiêu 4).
3. Đối tượng v phạm vi nghi n cứu
i. Đ i tượng nghi n ứu
Các dòng A. niger có khả năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao;
Dòng nấm mốc đối chứng gồm (i) dòng A. niger đối chứng nguồn gốc Nga (khoa
Sinh học, Trường Đại học Tổng hợp quốc gia Matxcova mang tê n Lomonosov -MGU) (ký hiệu R92) và (ii) dòng A. niger được phân lập từ đất (ký hiệu V) được
trữ mẫu ở Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Cần Thơ.
PME kỹ thuật có khả năng sử dụng trong thực tế.
ii. Phạm vi nghi n ứu
Các dòng A. niger bản địa được phân lập từ các nguồn nguyên liệu giàu pectin s n
có ở đồng b ng sông Cửu Long, có tính đặc hiệu đối với PME.
Phương thức lên men bề mặt trên môi trường rắn được chọn lựa dựa trên điều kiện
thí nghiệm đơn giản.
Chế phẩm enzyme PME kỹ thuật, chỉ qua tinh sạch sơ bộ có khả năng ứng dụng
thực tiễn trong cải thiện cấu trúc tế bào rau củ quả.
4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học v thực tiễn của luận án
Luận án đã nghiên cứu có tính hệ thống về pectin methylesterase của A. niger, bao
gồm các khâu phân lập, định danh, nuôi cấy vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme,
thu nhận, tinh sạch sơ bộ và thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme trong chế
biến thực phẩm (lĩnh vực cải thiện đặc tính cấu trúc rau quả).
iii. Những kết quả ý nghĩ kho h
Nghiên cứu đã phân lập được 60 dòng nấm mốc từ vỏ trái cây giàu pectin và tuyển
chọn được 02 dòng A. niger có nguồn gốc từ cam soàn (So
2
) và bưởi Năm Roi
(R
1
) đặc hiệu đối với PME.
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR 28S- rRNA gene) kết hợp với phương
pháp truyền thống trong định danh 04 dòng A. niger đặc hiệu đối với việc sinh
tổng hợp PME.
Một số tính chất cơ bản của chế phẩm PME được thu nhận từ canh trường nuôi
cấy tổ hợp hai chủng A. niger So
2
và A. niger R1
đã được xác định: nhiệt độ và pH
hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme, khả năng làm tăng hoạt tính PME của
một số ion kim loại ở nồng độ thích hợp như Na
+
và Ca
2+
.
iv. Những kết quả ý nghĩ về mặt ứng dụng
Xác định được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy để sinh tổng hợp
PME hoạt tính cao với nguồn giống A. niger chủ động được phân lập và tuyển
chọn tại chỗ (tổ hợp hai chủng A. niger So
2
và A. niger R1
).
Tận dụng được nguồn phụ phẩm nông nghiệp s n có tại địa phương là bã táo ta và
vỏ bưởi Năm Roi làm cơ chất lên men chính.
Đã chọn được điều kiện ly trích PME từ canh trường bề mặt, chọn được tác nhân
kết tủa và nồng độ thích hợp để tinh sạch enzyme.
Đã thử nghiệm ứng dụng chế phẩm PME thu được để xử lý nguyên liệu, giúp cải
thiện hiệu quả đặc tính cấu trúc tế bào rau quả, với hai sản phẩm điển hình là
khóm lạnh đông và dưa leo muối chua.
5. Cách tiếp cận v giả thu ết khoa học
Quá trình tuyển chọn cũng như lên men sinh tổng hợp PME từ dòng A. niger được
dựa trên các quy trình tham khảo cho các loại nấm mốc, cơ chất và enzyme có đặc
tính tương tự (Klich, 2002; Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006; Hamdy, 2005).
Thí nghiệm thăm dò so sánh hiệu quả sinh tổng hợp PME của hai phương thức lên
men bề mặt trên môi trường rắn (SSF) và lỏng (SmF) đã khẳng định SSF giúp gia
tăng hoạt tính PME 5 lần so với SmF (Nguyen et al., 2010).
Hoạt tính PME thu được khi sử dụng cơ chất là môi trường cơ bản (cám, bột mì,
vỏ trấu) thấp hơn 5 lần khi so sánh với trường hợp sử dụng bã táo lên men (Tran et
al., 2009). Do đó, nghiên cứu đề xuất sử dụng các phụ phẩm nông nghiệp s n có
như bã táo ta, vỏ cam, vỏ bưởi là thành phần cơ chất lên men chính cho nghiên
cứu sinh tổng hợp PME.
6. Kết cấu của luận án
Luận án bao gồm 3 phần: Phần Mở đầu (5 trang với 6 tiểu mục); Phần nội dung
gồm 3 chương chính (1) Chương 1: Tổng quan tài liệu (37 trang với 11 tiểu mục),
(2) Chương 2: Phương tiện – Phương pháp nghiên cứu (37 trang, gồm 3 tiểu mục
và 27 thí nghiệm theo 4 nội dung cơ bản, ngoài ra còn có 3 thí nghiệm phụ ở phụ
lục 2), (3) Chương 3: Kết quả - Thảo luận (72 trang, 8 tiểu mục); Phần Kết luận
và Đề nghị (2 trang, 2 tiểu mục). Số bảng và hình trong nội dung chính gồm 32
bảng và 61 hình. Bài viết sử dụng 233 tài liệu tham khảo, bao gồm 207 tài liệu
tiếng Anh, 26 tài liệu tiếng Việt.

CHƯƠNG 1 T NG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về enzyme pectin methylesterase
1.1.1 ổng qu n
Pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) là enzyme thuộc nhóm pectinase xúc
tác phản ứng thủy phân liên kết C-O của nhóm methyl ester ở C6
của một gốc
GalA trong homogalacturonan (HG) của pectin (hình 1.1). Hiệu suất thủy phân có
thể đạt đến 98% (Gonzalez và Rosso, 2011).
H n 1 1: Sơ đồ t ủy p ân pectin của PME
Ngu n: Jayani et al., (2005)
Các loại PME được tìm thấy trong rất nhiều loại thực vật và cũng được sản xuất từ
các loại vi sinh vật gây bệnh cho cây. Nội PME của thực vật có liên quan đến sự
chuyển hóa của pectin trong suốt quá trình phát triển của thực vật (Bordenave,
1996). Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có trách nhiệm trong việc
điều khiển sự thoái hóa của pectin và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình
chín. PME từ những nguồn khác nhau có những đặc trưng không giống nhau
(Bordenave và Goldberg, 1993).
1.1.2 ính hất sinh lý ủ PME
PME có kích thước trung bình hay phân tử khối vào khoảng 25 ư 54 kDa (Benen
et al., 2003). PME thu nhận từ những nguồn khác nhau có điểm đẳng điện (pI)
không giống nhau. Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ 3,1 đối với một số
enzyme được sinh tổng hợp từ nấm mốc đến giá trị pI là 11 trong trường hợp PME
ly trích từ cà chua. Hầu hết PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm,
chỉ một vài trường hợp PME có pI mang tính acid (Bordenave, 1996). Tuy nhiên,
điều này có thể liên quan đến phương pháp ly trích được sử dụng, bao gồm giai
đoạn loại bỏ các thành phần hòa tan trong mô tế bào ra khỏi các thành phần không
hòa tan của vách tế bào khi ngâm trong dung dịch đệm ion cao để ly trích PME
(Micheli, 2001).
Nhiều loại PME khác nhau về phân tử khối, điểm đẳng điện và hoạt tính sinh hóa
được tìm thấy ở các thực vật hai lá mầm (Bordenave, 1996; Bordenave và
Goldberg, 1994; Giovane et al., 2004). Việc đo lường hoạt tính đã chỉ ra có sự
khác biệt giữa các loại PME thu nhận từ các bộ phận khác nhau hoặc trong các
giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật (Bordenave và Goldberg, 1993) tuy
nhiên không có sự khác biệt lớn về tính chất PME trong cùng một nguồn vi sinh
vật, ngoại trừ PME từ Erwinia chrysanthemi (E. chrysanthemi) (Benen et al.,
2003).
1.1.3 Ki u phản ứng ủ PME
PME thủy phân chủ yếu trên nhóm methylester của D-galacturonan. Tùy theo sự
khác biệt về cách sắp xếp trong cấu tạo của các loại PME thực vật, nấm mốc và vi
khuẩn mà cơ chế phản ứng của mỗi loại sẽ khác nhau (Markovic và Janecek,
2004).
Hầu hết các PME có nguồn gốc thực vật đều thủy phân liên kết ester của pectin từ
đầu khử hoặc đầu không khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo
phân tử b ng cơ chế chuỗi đơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Phản ứng khử ester
bắt đầu ở gần nhóm carboxyl tự do hay từ đầu khử của mạch polygalacturonic (chỉ
tác dụng tại một vị trí trên mạch), kết quả tạo thành các gốc galacturonic bị khử
nhóm ester (Rexova - Benkova và Markovic, 1976; Markovic và Kohn, 1984;
Willats et al., 2001). Do hoạt động cần có nhóm carboxyl tự do trên mạch
galacturonic nên PME được ly trích từ thực vật ít hoạt động trên các pectin có độ
ester hóa cao hơn là các pectin có độ ester hóa từ 20 ư 30% (Evans và Machale,
1978; Seymour et al., 1991). Ngược lại, PME được sinh tổng hợp từ nấm mốc
(đặc biệt từ các dòng Aspergillus) có thể phân cắt cơ chất một cách ngẫu nhiên
(Ishi et al., 1979; Limberg et al., 2000). Ngoại trừ hai trường hợp của enzyme
PME có nguồn gốc từ nấm mốc Trichoderma reesei - khử gốc ester theo từng
nhóm (Markovic và Kohn, 1984) và PME từ vi khuẩn E. chrysanthemi - thực hiện
phản ứng khử gốc ester tương tự như ở PME chiết xuất từ thực vật (Christensen et
al., 2001). Điều này chi phối đáng kể đến các phản ứng tiếp theo của quá trình khử
ester.
Khi phản ứng thủy phân theo vị trí cố định – thường xảy ra do tác động của PME
nguồn gốc thực vật, các pectin đã bị khử ester sẽ tạo gel khi có sự hiện diện của
ion calcium (Micheli, 2001) giúp thành tế bào trở nên cứng chắc. Trong trường
hợp không có sự kết hợp của Ca
2+
vào mạch pectin, enzyme polygalacturonase
(PG) và enzyme pectate lyase (PL) sẽ hoạt động và thủy phân ngẫu nhiên mạch
polymer của pectin (Duvetter, 2007).

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt (26 t i liệu)
1. Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Văn Huy (2000), i nấm dùng trong C ng Ngh inh
H , NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội, Việt Nam.
2. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010), Gi o trình Nấm h , NXB Đại học
Cần Thơ, Việt Nam.
3. Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm (2009a), “Công nghệ protein”, Trích dẫn
từ: Cơ sở ng ngh sinh h (chủ biên Đặng Thị Thu), NXB Giáo dục, Việt Nam.
4. Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm (2009b), “Công nghệ enzyme”, Trích dẫn
từ: Cơ sở ng ngh sinh h (chủ biên Đặng Thị Thu), NXB Giáo dục, Việt Nam.
5. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy và Nguyễn Xuân Sâm
(2004), C ng ngh enzyme, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, Việt Nam.
6. Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong (2005), Giáo trình enzyme, NXB Đại học Huế,
Việt Nam.
7. Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọc Hùng (2008), “Thu nhận enzyme pectinase từ A.
niger – Tinh sạch b ng phương pháp lọc gel và lọc màng”, ạp hí Ph t tri n Kho
h v C ng ngh , 8(11), tr. 46-50.
8. Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành (2010), Cơ sở C ng ngh vi sinh v t v ứng dụng,
NXB Giáo dục, Việt Nam.
9. Lê Ngọc Tú (2002), H sinh C ng nghi p, NXB Khoa học Kỹ thuật, Việt Nam.
10. Lê Thị Thanh Hương và Nguyễn Thùy Châu (2005), “Phân lập tuyển chọn một số
chủng nấm Aspergillus niger sinh enzym pectinase cao từ một số phế phụ phẩm
nông sản”, ạp hí N ng nghi p v ph t tri n N ng th n, 15, tr. 37- 42.
11. Lê Thị Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh H ng và Lê
Thị Lan Chi (2009), C phương ph p phân tí h ng nh C ng ngh lên men, NXB
Khoa học Kỹ thuật, Việt Nam.
12. Lê Trần Bình và Quyền Đình Thi (2009), “Công nghệ Gen”, Trích dẫn từ: Cơ sở
ng ngh inh h , 1, NXB Giáo dục, Việt Nam.
13. Lê Văn Nhương, Giang Thế Bính và Nguyễn Lân Dũng (1978), hu nh n v ứng
dụng hất hoạt động sinh h từ vi sinh v t, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Việt
Nam.
14. Lê Xuân Phương (2007), “Sinh lý đại cương vi sinh vật”, The Viet Nam Open
Course Ware Thesis.
15. Lương Đức Phẩm (2004), C ng ngh vi sinh v t, NXB Nông nghiệp, Việt Nam.
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ
Chuyên ngành Vi sinh v t h 158 i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h
16. Ngô Tiến Hiển (2001), “Ứng dụng công nghệ tiên tiến trong chế biến nông sản thực
phẩm”, Hội nghị Khoa h c, Công ngh v M i trường các tỉnh miền Đ ng N m bộ
lần 7, tr. 314 – 320.
17. Nguyễn Đức Lượng (2004), C ng ngh enzyme, NXB Đại học Quốc gia Thành phố
Hồ Chí Minh, Việt Nam.
18. Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường (2003), “Thí nghiệm hóa sinh học”, Trích dẫn từ:
hí nghi m ng ngh sinh h , 1, NXB Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,
Việt Nam.
19. Phạm Thị Trân Châu (1988), “Thực hành hóa sinh học”, NXB Khoa học Kỹ thuật,
Việt Nam.
20. Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa (2002), Enzyme v Ứng dụng, NXB Giáo
Dục, Việt Nam.
21. Phí Quyết Tiến (1999), “Nghiên cứu thu nhận enzyme pectinase từ nấm mốc b ng
phương pháp nuôi cấy bề mặt”, Lu n văn hạ sĩ rường Đại h N ng nghi p I, Hà
Nội, Việt Nam.
22. Trần Nhân Dũng (chủ biên) (2011), ổ t y thự h nh inh h phân tử, NXB Đại
học Cần Thơ, Việt Nam.
23. Trần Thanh Trúc, Dương Thị Thúy Oanh, Lý Nguyễn Bình, Nguyễn Văn Mười
(2006), “Động học sự thay đổi cấu trúc khóm ở các điều kiện tiền xử lý khác nhau”,
ạp hí Kho h rường Đại h Cần hơ, 6, tr. 18- 23.
24. Trần Thanh Trúc, Lê Thị Ngọc Hiếu và Nguyễn Văn Mười (2008), “Động học sự
thay đổi cấu trúc khóm ở các chế độ xử lý nhiệt khác nhau”, Kỷ yếu Hội nghị kho
h “Cây ăn tr i qu n tr ng ở Đ ng bằng s ng Cửu Long”, NXB Nông nghiệp Việt
Nam, tr. 300- 308.
25. Trần Thanh Trúc, Nguyễn Văn Mười, Nguyễn Văn Thành, Dương Đỗ Thành Lân,
Nguyễn Thị Kiều Linh, Lê Vương Hải Nguyệt, Lê Thị Ngọc Hiếu, Nguyễn Tấn Đạt,
Võ Thị Kiên Hảo, Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Vương Tố Trinh (2012), “Nghiên cứu
khả năng sinh pectin methylesterase từ một số dòng Aspergillus niger được phân lập
và tuyển chọn”, Đề tài NCKH cấp Bộ, Bộ Giáo Dụ v Đ o tạo, B2010-16-161
26. Trần Xuân Ngạch (2007), C ng ngh enzyme, NXB Đại học Bách Khoa Đà N ng,
Việt Nam.
Tiếng Anh (207 t i liệu, từ số 27 đến 233)
27. Abdel-Naby M. A., Sherif A. A., El-Tanash A. B. & Mankarios A. T. (1999),
“Immobilization of Aspergillus oryzae pectinesterase and properties of the
immobilized enzyme” Appl. Microbiol. Biotechnol., 87, pp. 108-114.
28. Acıkel U., Ersan M. and Sag Acıkel Y. (2010), “Optimization of critical medium
components using response surface methodology for lipase production by Rhizopus
delem r”, Food and Bioproducts Processing, 88(1), pp. 31–39.
29. Aehle W. (2004), Enzyme in Industry – Production and Applications, Wiley VCH.
30. Alkorta I.C., Garbisu M.J., Liama J.L. and Serra Y. (1998), “Industrial applications
of pectic enzymes: A review”, Process Biochemistry, 33, pp. 21– 28.
31. Al-Musallam A.A. (1980), “Aspergillus helicothrix sp.nov. Antonie van
Leeuwenhoek”, Journ l of Mi robiology nd Derology, 46, pp. 407– 411.
32. Arotupin D.J, Akinyosoye F.A and Onifade A.K. (2008), “Purification and
characterization of pectin methylesterase from Aspergillus repens isolated from
cultivated soil”, Africa Journal of biotechnology, 7(2), pp. 1991–1998.
33. Atlas R. M. (2010), Handbook of Microbiological Media, Fourth Edition. CRC
Press. Washington DC.
34. Awad M. and Young R.E. (1980), “Avocado pectin methylesterase activity in
relation to temperature, ethylene, and ripening”, Journal of the American Society for
Horticultural Science, 105, pp. 638 – 641.
35. Bai Z.H., Zhang H.X., Qi H.Y., Peng X.W. and Li B.J. (2004), “Pectinase
production by Aspergillus niger using waste water”, In: Solid state fermentation for
eliciting plant disease resistance, Bioresource Technology, 95, pp. 49 – 52.
36. Baker R.A. and Wicker L. (1996), “Enzyme applications for agro–processing in
developing countries: an inventory of current and potential applications”, World
Journal of Microbiology and Biotechnology, 14 (5), pp. 611– 619.
37. Balestrieri C., Castaldo D., Giovane A., Quagliuolo L. and Servillo L. (1990),
“A glycoprotein inhibitor of pectin methylesterase in kiwi fruit (Actinidia
chinensis)”, European Journal of Biochemistry, 193(1), pp. 183–187.
38. Bali R. (2003), Isolation of extracellular fungal pectinolytic enzymes and extraction
of pectin using kinnow waste as substrate, Thesis of Master of science
(Biotechnology), India.
39. Banerjee R. (2006), “Isolation and Purification of Enzyme”, In: Enzyme Technology,
Pandey A., Webb C., Soccol C.R., Larroche C. (Editors), Springer, pp. 515 – 532
40. Banjongsinsiri P., Kenney J. and Wicker L. (2004), “Detection of vacuum Infusion
of pectin methylesterase in strawberry by activity staining”, Food chemistry and
toxicology, 13, pp. 1124 – 1131.
41. Banu A.R., Devi M.K., Gnanaprabhal G.R., Pradeep B.V. and Palaniswamy M.
(2010), “Production and characterization of pectinase enzyme from Penicillium
hysogenum”, Indi n Journ l of ien e nd e hnology, 3(4), pp. 377 – 381.
42. Barredo J.L. (2005), Microbial enzymes and Biotransformations, Humana Press Inc.,
Totowa, New Jersey.
Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ
Chuyên ngành Vi sinh v t h 160 i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h
43. Bartolomé A. P., Rupérez P. and Fúster C. (1995), “Pineapple Fruit: Morphological
Characteristics, Chemical Composition and Sensory Analysis of Red Spanish and
Smooth Cayenne Cultivars”, Food Chemistry, 53, pp. 75 – 79.
44. Bayoumi R.A., Yassin H.M., Swelim M.A. and Abdel-Al E.Z. (2008), “Production
of Bacterial Pectinase(s) from Agro-Industrial Wastes Under Solid State
Fermentation Conditions”, Journal of Applied Sciences Research, 4(12), pp. 1708 –
1721.
45. Bell T.A., Etchells J.L. and Jones I.D. (1951), “Pectinesterase in cucumber”, Journal
Series of the North Carolina Agricultural Experiment Station, 351, pp. 431–441.
46. Bell T.A., Etchells J.L., and Jones I.D. (1950), “Softening of commercial cucumber
salt-stock in relation to polygalacturonase activity”, Journal of Food Technology, 4
(4), pp. 157–163.
47. Bemiller J. N. and Kumari G. V. (1972), “Beta-elimination in uronic acids: evidence
or an ELCB mechanism”, Carbohydrate Research, 25, pp. 419–428.
48. Benen J.A.E., Van Alebeek G. J. W. M., Voragen A. G. J. and Visser L. (2003),
“Pectin esterases”, In: Handbook of Food Enzymology. Whitaker J. R., Voragen A.
G. J. and D. W. S. Wong, Eds, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 849–856.
49. Bhalla T.C. and Chatanta D.K. (2000), “Application of enzymes in food processing”,
In: Food Processing: Biotechnological Applications, Marwaha, S.S. and Arora J.K,
Asiatech Publishers, Inc.
50. Boccas F., Roussos S., Gutierrez M., Serano L. and Viniegra G. G. (1994),
“Production of Pectinase from coffee pulp in solid state fermentation system:
Selection of wild fungal isolate of high potency by a simple three-step screening
technique”, Journal of Food Science and Technology, 31(1), pp. 22–26.
51. Bordenave M. (1996), “Analysis of pectin methylesterase”, In: Plant Cell Wall
Analysis, Linskens H. F., Eds.; Springer, Berlin, pp. 165–180.
52. Bordenave M. and Goldberg R. (1993), “Purification and characterization of pectin
methylesterases from mung bean hypocotyl cell walls”, Phytochemistry, 33, pp 99 –
103.
53. Bordenave M. and Goldberg R. (1994), “Immobilized and free apoplastic pectin
methylesterases in mung bean hypocotyl”, Plant Physiology, 106, pp. 1151 – 1156.
54. Bradford M. M. (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein - dye binding”,
Analytical Biochemistry, 72, pp. 248–254.
55. Brady C.J. (1976), “The pectinesterase of pulp banana fruit”, Australian Journal of
Plant Physiology, 3, pp. 163–172.