Thạc Sĩ Phân Lập và tuyển chọn môt số chủng vi khuẩn cố định nito tự do Azotobacter sp. Trên một số loại đất

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Giữa đất, vi sinh vật và cây trồng có mối quan hệ tác động qua lại lẫn
nhau. Quá trình hình thành đất và độ phì của đất chịu ảnh hưởng của các yếu tố
vật lí, hóa học và vi sinh vật. Vi sinh vật tổng hợp và giải phóng vào đất những
chất hữu cơ cần thiết tạo độ phì cho đất, ngược lại đất là môi trường sống cần
thiết cho vi sinh vật, đất và vi sinh vật cùng tác động rất lớn đến cây trồng, đặc
biệt cung cấp nguồn dinh dưỡng, một trong các nguồn dinh dưỡng quan trọng
cho cây trồng là nguồn nitơ [8].
Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng
lấy đi khỏi đất khoảng 30 kg nitơ [3]. Theo thống kê hàng năm các sản phẩm
nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ (G.
Colar và Greenland) [3]. Trong khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù
đắp được một phần lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất. Lạm dụng quá mức việc
sử dụng phân hóa học làm đất xấu đi, mất cân đối các chất dinh dưỡng và làm
giảm hệ vi sinh vật có ích, hơn nữa việc sản xuất phân nitơ hóa học còn gặp
nhiều khó khăn, giá thành khá cao. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để bổ sung
lượng dinh dưỡng nitơ cho đất một cách có hiệu quả nhất, vừa tiết kiệm được chi
phí sản xuất, bảo vệ được môi trường.
Một trong những giải pháp đang được áp dụng để cải tạo đất hiện nay là
sử dụng phân bón vi sinh vật. Nhóm vi sinh vật trong phân có tác dụng cải thiện
độ phì, cân bằng dinh dưỡng trong đất, cải thiện các tính chất lý, hóa của đất, và
đặc biệt hạn chế ô nhiễm môi trường, cũng như ô nhiễm môi trường nước do quá
trình rửa trôi [1].
Trong tự nhiên, ngoài nguồn nitơ được tạo ra cho đất từ quá trình amon hóa,
quá trình nitrat hóa, nguồn nitơ còn được tạo ra từ quá trình cố định nitơ phân tử
được thực hiện bởi các nhóm vi sinh vật trong đất, trong đó có sự đóng góp của
nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. Các vi sinh vật thuộc nhóm này có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ mà cây
trồng có khả năng hấp thụ được [3].
Azotobacter sp. là một loại vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất, chúng
có khả năng cố định đạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ. Ngoài đặc điểm
trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA
(chất kích thích sinh trưởng ở thực vật). Chính nhờ đặc điểm quan trọng đó vi
khuẩn Azotobacter sp. được ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm phân bón vi
sinh vật làm tăng năng suất cây trồng.
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về vi sinh vật cố định nitơ
tự do trên một số loại đất để làm phân vi sinh, nhưng hiện nay chưa có một
nghiên cứu nào về thành phần loài thuộc chi Azotobacter sp. trên một số loại đất
ở Đăk Lăk.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập
và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. trên
một số loại đất ở Đăk Lăk”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Tuyển chọn được một số chủng Azotobacter sp. cố định đạm cao trên một
số loại đất ở Đăk Lăk.
- Đánh giá hiệu quả của một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp. đối với sự
sinh trưởng của cây cải ngọt (Brassica juncea)
3. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
Đề tài góp phần phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp.
bản địa có khả năng cố định đạm cao trên một số loại đất ở Đăk Lăk, góp phần
vào công công tác bảo tồn đa dạng vi sinh vật ở Đăk Lăk và Tây Nguyên.
Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azotobacter sp. trên một số
loại đất ở Đăk Lăk có hoạt tính cố định nitơ cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất
cây trồng và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên
Trong nước, nitơ chủ yếu ở dạng hợp chất của NH 4
+ , NO 2
- , NO 3
- . Trong đất
có 2 dạng nitơ tồn tại đó là nitơ vô cơ trong các muối khoáng và nitơ hữu cơ
trong xác, chất bài tiết từ sinh vật. Các hợp chất chứa nitơ trong xác, chất bài tiết
của động vật và thực vật bị một số loại nấm và vi khuẩn phân giải.
Trong đất amon hầu như chuyển hóa toàn bộ thành hợp chất nitrat. Phần lớn
hợp chất nitrat được thực vật hấp thụ, phần còn lại bị mất đi do mưa rửa trôi và
tác dụng của phản nitrat hóa.
Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất một phần như gốc rễ được trả lại đất,
phần còn lại được động vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất
bài tiết trả lại đất. Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh
vật, nấm bị khử thành đạm ở dạng hữu hiệu.
Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N 2 ) chiếm khoảng
80%, ở dạng nguyên tử kép (N 2 ) được khóa chặt với nhau thông qua liên kết
cộng hóa trị bền vững (N≡N). Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có
thể hấp thụ được nitơ ở dạng NO 3
- và NH 4
+ [3]. Để sử dụng được nguồn nitơ lớn
từ không khí có 2 con đường chính là hóa học và sinh học.
Hóa học: Kể từ năm 1920, phương pháp công nghiệp Haber - Bosch đã
giúp con người phá vỡ liên kết ba này. Biện pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở
nhiệt độ rất cao (450 – 500 o C), áp suất là 125 atm và Fe 3+ là chất xúc tác. Các
hợp chất nitơ được tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ
lớn và ổn định. Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân đạm tổng hợp hóa học
cho nông nghiệp có thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng đem lại những tác
hại cũng không nhỏ, vì trung bình chỉ có 40 – 50 % lượng đạm bón được cây hấp
thu, phần còn lại gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí từ đó gây hại
thậm chí là tiêu diệt các sinh vật có lợi. Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa
học gây hại rất lớn đối với cá, động vật thân mềm và kể cả con người. Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase để thực hiện
quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng
thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Việc sử dụng
phân bón vi sinh làm đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường
khả năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi
xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn. Ngoài ra, còn có các con đường tạo
nitơ khác như do sấm chớp hay cháy [12].
1.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật
Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein,
diệp lục, ATP Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao
động từ 1 – 3%. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý đặc
biệt quan trọng trong đời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của
cây trồng. Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp
đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên
năng suất giảm. Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất của cây trồng. như cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng
nhanh nên cây rất yếu, dễ đổ, thu hoạch gặp nhiều khó khăn.
1.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên
1.3.1. Quá trình khoáng hóa
Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của
quần thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt,
tùy thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau. Giai đoạn
này có sự tham gia của các chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và
Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa những hợp chất
chứa nitơ thành nitrat (NO 3
- ), một dạng thích hợp để cho cây trồng hấp thu. 1.3.2. Quá trình phản nitrat hóa
Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí
dưới tác dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ.
1.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử
Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium
sống cộng sinh ở rễ cây họ đậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến đổi N 2 trong
không khí thành NH 3 , từ NH 3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung
cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất. Để quá trình này xảy
ra thì phải có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong
điều kiện này enzyme nitrogenase mới hoạt động).

Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định nitơ của vi khuẩn sống tự do
trong đất.
NO 3
-
Vi khuẩn phản nitrat hóa
N 2
N 2 + H 2
Nitrogenase
Vi khuẩn cố định đạm
NH 3
H 2 O
NH 4
+
NH 4
+
NO 2
-
Vi khuẩn nitrat hóa
Nitrosomonas
NO 2
- NO 3
-
Nitrobacter
Hợp chất hữu cơ
Vi khuẩn amon hóa
NH 4
+Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định N 2 của vi sinh vật cho đến nay vẫn
chưa được sáng tỏ hoàn toàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả
thuyết cho rằng NH 3 là sản phẩm đồng hóa sơ cấp của N 2 và có thể nêu ra giả
thuyết về 2 con đường cố định N 2 của vi khuẩn sống tự do trong đất như sau:
Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản
ứng cố định N 2 được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16 – 20 Kcal/M, song lượng
năng lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật. Tốc độ phản ứng nhanh
chóng trong tế bào vi sinh vật ở nhiệt độ thấp nhờ có hệ thống hydrogenase hoạt
hóa H 2 và nitrogenase hoạt hóa N 2 .
Năm 1961 – 1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu
phần hoạt hóa H 2 và N 2 . Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter cũng có các
tiểu phần đó. Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố
khoáng Mo và Fe. Nguồn hydro để khử N 2 có thể là hydro phân tử (H 2 ). Trong trường hợp này
thì dưới tác dụng của hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống:
Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình
chuyền điện tử có sự tham gia tích cực của feredoxine (Fd). Fd là cầu nối giữa 2
hệ enzyme hydrogenase và nitrogenase để cố định N 2 .
Sự cố định N 2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn.
Trong các nốt sần có một chất có bản chất HEM rất giống với hemoglobin trong
máu gọi là leghemoglobin. Nó dễ dàng liên kết với O 2 để biến thành
oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh
với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo
leghemoglobin và không cố định được N 2 . Những nghiên cứu gần đây về quá
trình cố định N 2 cho thấy quá trình cố định này đòi hỏi:
Có sự tham gia của enzyme nitrogenase. Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa
cho quá trình này. Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí.
Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP, .)