Thạc Sĩ Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính Chitinase cao tại tỉnh Đắc Lắc

MỤC LỤC
Mở đầu
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu của đề tài 1
3. Ý nghĩa khoa học 2
4. Ý nghĩa thực tiễn 2
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Tổng quan về chitin và chitinase 3
1.1.1. Chitin 3
1.1.1.1. Cấu tạo chitin 3
1.1.1.2. Phân bố và số lượng 3
1.1.1.3. Đặc điểm khác 4
1.1.1.4. Ứng dụng 5
1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) 6
1.2.1. Khái niệm 6
1.2.2. Phân loại chitinase 7
1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử 7
1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid 7
1.2.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt 9
1.2.3. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 9
1.2.3.1. Chitinase vi khuẩn 9
1.2.3.2. Chitinase nấm 10
1.2.3.3. Chitinase thực vật 10
1.2.3.4. Chitinase động vật 11
1.2.4. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase 11
1.2.4.1. Khối lượng phân tử 11
1.2.4.2. Điểm đẳng điện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis 11
1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 12 1.2.4.4. Ảnh hưởng của pH 12
1.2.4.5. Chất tăng hoạt, chất ức chế 12
1.2.4.6. Sự ổn định 14
1.2.5. Các loại cơ chất của enzyme chitinase 14
1.2.5.1. Chitin 14
1.2.5.2. Các dẫn xuất của chitin 14
1.2.6. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase 15
1.3. Tổng quan về nấm mốc 15
1.3.1. Khái niệm 15
1.3.2. Hình dạng và kích thước 16
1.3.3. Cấu tạo tế bào sợi nấm 17
1.3.4. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc 17
1.3.5. Vị trí và vai trò của nấm mốc 18
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nội dung nghiên cứu 23
2.2. Vật liệu và thiết bị 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu 23
2.3.1. Địa điểm thu thập mẫu 23
2.3.2. Các loại môi trường 23
2.3.3. Phương pháp phân lập 24
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 24
2.3.5. Xác định hoạt độ chitinase theo phương pháp định lượng đường khử
với thuốc thử DNS
25
2.3.6. Phương pháp định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 28
2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
28
2.3.8. Nghiên cứu xác định tác nhân tủa phù hợp 29
2.3.9. Xác định tính chất cơ bản của chitinase 30
2.3.9. Xử lý số liệu 33
Chương 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk 34
3.2. Tuyển chọn và định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 40
3.3. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
42
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ chitin trong môi trường nuôi cấy 42
3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 43
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 45
3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 46
3.3.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 48
3.3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 49
3.4. Tác nhân tủa phù hợp cho quá tình tách chiết chitinase từ nấm mốc
Penicillium janthinellum
50
3.5. Xác định một số tính chất cơ bản của chitinase từ nấm mốc
Penicillium janthinell
52
3.5.1. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase 52
3.5.2. Xác định pH tối ưu cho hoạt tính chitinase 53
3.5.3. Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 54
3.5.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính chitinase 56
3.5.5. Xác định thời gian phản ứng tối ưu 57
3.5. Tinh sạch chitinase 58
Kết luận và kiến nghị 61
Tài liệu tham khảo 62
Phụ lục 67 DANH MỤC BẢNG
Bảng 3 .1. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk . 34
Bảng 3.2. Hàm lượng đường khử trong dịch nuôi cấy và hoạt tính chitinase của các
chủng nấm mốc 37
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
nồng độ chitin khác nhau 43
Bảng 3.4. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy bổ sung
các nguồn nitơ khác nhau . 44
Bảng 3.5. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
nhiệt độ khác nhau . 46
Bảng 3.6. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
pH khác nhau . 47
Bảng 3.7. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
tốc độ lắc khác nhau . 48
Bảng 3.8. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy trong
các khoảng thời gian khác nhau 49
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hiệu suất thu hồi và hoạt tính chitinase của
nấm mốc Penicillium janthinellum . 51
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính chitinase 55
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt tính chitinase . 57
Bảng 3.12. Hàm lượng protein, HTch, HTr trước và sau khi lọc gel . 59DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của chitin . 3
Hình 2.1. Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase . 25
Hình 2.2. Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS . 25
Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk . 39
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hoạt tính chitinase . 43
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến hoạt tính chitinase 44
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính chitinase . 46
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt tính chitinase 47
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hoạt tính chitinase . 49
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính chitinase . 49
Hình 3.8. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính
chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum 52
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính chitinase 53
Hình 3.10 . Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chitinase 54
Hình 3.11 . Ảnh hưởng của nồng độ chitin đến hoạt tính chitinase . 55
Hình 3.12 . Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính chitinase . 56
Hình 3.13 . Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt tính chitinase 57
Hình 3.14 . Kết quả đo mật độ quang dịch protein sau lọc gel Sephadex 59
Hình 3.15 . Ảnh hưởng của phương pháp lọc gel tới hàm lượng protein, HTch, HTr
của chitinase 60
Hình 3.16 . Kết quả đo mật độ quang dịch protein sau tinh sạch bằng cột chitin 60
Hình 3.17 . Hình 3.17. Vòng phân giải chitin . 60 DANH MỤC ẢNH
Ảnh 3.1 Khuẩn lạc của 34 chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk . 37
Ảnh 3.2 Hình thái của 3 chủng nấm mốc D4, D9, D31 41