Luận Văn Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm

Đồ án tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG . vi
DANH MỤC HÌNH . vii
LỜI NÓI ĐẦU . 1
Chương I. TỔNG QUAN 2
1.1. Tình hình bảo quản nguyên liệu thực phẩm . 2
1.1.1. Trên thế giới 2
1.1.2. Ở Việt Nam 6
1.2. Tổng quan về bacteriocin 8
1.2.1. Đặc điểm chung về bacteriocin . 8
1.2.2. Phân loại bacteriocin 9
1.2.3. Một số tính chất của bacteriocin . 11
1.2.3.1. Độ bền nhiệt . 11
1.2.3.2. Độ bền pH 11
1.2.3.3. Độ bền với các enzyme 11
1.3. Tổng quan về vi khuẩn lactic . 13
1.3.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic . 13
1.3.2. Phân loại vi khuẩn lactic 13
1.3.3. Đặc điểm sinh trưởng . 15
1.3.4. Ứng dụng . 16
1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 18
1.4.1. Trên thế giới 18
1.4.2. Ở Việt Nam . 21
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 23
2.1. Vật liệu . 23
2.1.1. Mẫu . 23
2.1.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị . 23
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng . 24
2.1.4. Hóa chất, môi trường và thuốc thử . 24
2.2. Phương pháp nguyên cứu . 28
2.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ mẫu nước dưa lên
men truyền thống có khả năng sinh bacteriocin 29
2.3.1. Phân lập vi khuẩn . 29
2.3.2. Nuôi cấy và bảo quản chủng vi khuẩn . 31
2.3.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic . 32
2.3.4. Thử với enzym proteinase K và α-chymotrypsin 34
2.3.5. Xác định độ bền nhiệt của dịch bacteriocin 35
2.3.6. Xác định độ bền pH đối với dịch bacteriocin thô . 36
2.3.7. Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic sinh bacteriocin . 36
Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa muối lên men truyền thống 38
3.2.Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 38
3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic . 38
3.2.2. Kết quả kiểm tra với enzym proteinase K và α-chymotrypsin . 41
3.3. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô 42
3.3.1. Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô 43
3.3.2. Độ bền pH của dịch bacteriocin thô . 44
3.4. Một số đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn lactic sinh
bacteriocin 45
3.5. Đặc điểm của các chủng vi khuẩn sinh bacterio cin được phân lập bổ
sung từ ruột cá giò 47
3.5.1. Phân lập chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ ruột cá giò 47
3.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn từ mẫu ruột cá giò . 48
3.5.3. Kết quả kiểm tra với enzym proteinase K và α-chymotrypsin . 50
3.5.4. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô của chủng CT 1.1 51
3.5.5. Một số đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn phân lập từ mẫu ruột cá
giò sinh bacteriocin . 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56


LỜI NÓI ĐẦU
Thực phẩm là một trong những nhu yếu phẩm không thể thiếu trong đời sống
hằng ngày của mỗi người. Thực phẩm phải tươi, ngon theo đúng nghĩa của nó mà
không bị mất đi giá trị dinh dưỡng ban đầu, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con
người. Những yêu cầu trên cũng chính là đòi hỏi hàng đầu của các phương pháp bảo
quản thực phẩm. Vì hầu hết các loại nông sản thực phẩm tươi sống ở nước ta
thường được bảo quản bằng các chất hóa học. Tuy nhiên, phương pháp này chưa
đáp ứng được yêu cầu về an toàn thực phẩm. Hiện nay trên thế giới, các nhà khoa
học đã tìm được một phương pháp bảo quản thực phẩm bằng sinh học nhưng còn
khá mới mẻ ở nước ta – chính là sử dụng bacteriocin làm chất bảo quản sinh học an
toàn. Mặc dù có một vài phương pháp khác bacteriocin, nó có thời gian bảo quản
lâu hơn nhưng ngày nay con người càng ý thức nhiều về sức khỏe nên họ tránh
dùng những thực phẩm được bảo quản bằng chất hóa học.
Chính vì vậy, việc thực hiện đề tài:
―Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên
men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm‖ là rất cấp thiết.
Đề tài này được tiến hành với các mục tiêu sau:
+ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa muối lên
men truyền thống
+ Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn
được
+ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin


Chương I. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình bảo quản nguyên liệu thực phẩm
1.1.1. Trên thế giới
Trong suốt chiều dài lịch sử, con người đã thích ăn thực phẩm còn tươi hơn
là các dạng thực phẩm khác như bị ươn, thực phẩm dạng sấy khô . Tuy nhiên, do
thực phẩm hư hỏng rất nhanh nên từ lâu loài người đã phải phát triển những phương
pháp để bảo quản nguyên liệu thực phẩm.
Có rất nhiều phương pháp bảo quản thực phẩm trên thế giới, song nhìn
chung các phương pháp đều tuân thủ theo ba nguyên tắc Bioza, Abiosis và
Anabioza. Thực chất các nguyên tắc này như sau:
Theo nguyên tắc Bioza (Bios = sự sống) thì thực phẩm được cất giữ ở điều
kiện vệ sinh tốt, với môi trường vô trùng tuyệt đối để luôn luôn giữ nguyên trạng
thái tươi sống ban đầu của nguyên liệu. Ví dụ, thịt lợn, thịt bò tươi trong phòng
mát, vô trùng luôn được giữ ở nhiệt độ 0
0
C – 10
0
C. Tuy nhiên, các phương pháp
này không thích hợp ở điều kiện nhiệt đới, lại đòi hỏi thiết bị đắt tiền, do vậy ở Việt
Nam rất ít ứng dụng.
Còn theo nguyên tắc Abioza (Abiosis = không sống), người ta dùng những
biện pháp đình chỉ hoàn toàn sự sống của vi sinh vật gây nhiễm. Dưới tác dụng của
các yếu tố diệt khuẩn như vậy thì bản thân khối nguyên liệu được bảo quản cũng
thay đổi trạng thái, không còn tươi sống nữa. Thuộc nguyên tắc này có ba phương
pháp được sử dụng như thanh trùng ở nhiệt độ cao, chiếu xạ và siêu âm, dùng hóa
chất bảo quản. Thanh trùng ở nhiệt độ cao còn gọi là sử dụng quá trình nhiệt nóng.
Vì là dưới tác dụng của nhiệt, hoặc do chính các tế bào vi sinh vật bị tiêu diệt, hay
do chính các enzym quan trọng của chúng bị bất hoạt, do vậy không gây nhiễm
được. Cũng tùy vào loại thực phẩm người ta có thể thực hiện việc khử trùng nguyên
liệu ở ba khoảng nhiệt độ khác nhau, kéo dài trong những khoảng thời gian nhất
định. Ví dụ như đối với loại thực phẩm có nhiều đường bột dễ cháy cần duy trì ở
80
0
C–90
0
C trong 30–45 phút, những nguyên liệu dạng đạm duy trì ở 90
0
C–100
0
C
trong 45–60 phút còn với những nguyên liệu dạng đồ hộp hoặc vỏ giáp cứng có thể
duy trì ở 110 –150
0
C ở áp suất 1,2 -1,5at.
Phương pháp chiếu xạ và siêu âm sử dụng các tia hồng ngoại, tia bức xạ
dạng α, β, γ gây oxi hóa hoặc ion hóa ; do đó tạo ra một trong những hiệu quả
dưới đây đối với vi sinh vật: thay đổi thành phần cấu trúc tế bào, phá vỡ màng, bất
hoạt hệ enzym và song siêu âm với tần số trên 20000 Hz phá vỡ màng tế bào. Trên
thế giới, 37 quốc gia đã có luật cho phép chiếu xạ thực phẩm và có hơn 30 nhà máy
chiếu xạ thực phẩm đã được xây dựng. Ở Mỹ cho đến nay Cục quản lý thực phẩm
và thuốc của Mỹ đã cấp phép cho các loại thực phẩm: lúa mì, bột mì, khoai tây, thịt
lợn, hoa quả, rau, gia vị, gia cầm, thức ăn gia súc, thịt đỏ, trứng, sò. Đối với thực
phẩm đã chế biến và hải sản đang được xem xét để cấp phép. Tuy nhiên, hạn chế
lớn của phương pháp này là giá thành rất cao và đôi khi không an toàn cho người
thực hiện cũng như người tiêu dùng do thiếu hiểu biết về cách thức sử dụng, do đó
ít được sử dụng ở các nước kém phát triển.
Phương pháp sử dụng hóa chất để bảo quản có tác dụng sát trùng bằng các
loại hợp chất vô cơ cũng như hữu cơ. Cơ chế tác dụng của nó thể hiện qua nhiều
phương thức khác nhau như: phá hủy thành phần cấu trúc tế bào, ngăn ngừa sự sinh
tổng hợp enzym và các protein cấu trúc khác (theo cơ chế cảm ứng hoặc ức chế),
gây rối loạn quá trình thẩm thấu qua màng tế bào. Các loại hóa chất thường dùng
gồm:
Các hợp chất sulfit và bisulfit như K2SO
3
, Na
2SO
3
, Na
2HSO
3, KHSO
3
,
Ca(HSO3
)
2
. Các hợp chất này thường dùng với nồng độ dưới 3%. Tác dụng của nó
ức chế quá trình sinh tổng hợp protein có chứa S (theo cơ chế cảm ứng). Điều cần
lưu ý là những hợp chất này là những hợp chất trên đều gây độc hại cho người tiêu
dùng, do vậy không được dùng quá liều quy định.
Ngoài các hợp chất nói trên người ta còn sử dụng một số vài loại kháng sinh
có hoạt tính kháng khuẩn mạnh như Tyrozin, Biomycine những chất này có tác
dụng tốt với vi khuẩn nhưng ít hiệu quả với nấm mốc.
Cuối cùng là nguyên tắc Anabioza (= giảm sức sống) (Anabiosis = dạng sống
ngầm = sống tiềm sinh), người ta áp dụng những biện pháp nhằm hạn chế sự phát
triển của vi sinh vật và hạn chế các hoạt tính của các enzym nhưng không giết chết
hoặc đình chỉ hoàn toàn. Thuộc nguyên tắc này có 5 biện pháp chính thường được
sử dụng:
Ứng dụng quá trình lạnh là phương pháp có tên gọi khác là ― Lưu trữ thực
phẩm ở trạng thái lạnh hay đông lạnh‖. Clarence Birdseye, nhà phát minh người
Mỹ, chế tạo hệ thống làm lạnh nhanh. Với một cái quạt điện, vài thanh đá lớn và ít
nước muối ông đã hoàn thành hệ thống làm đông lạnh nhanh của mình. Hệ thống có
thể làm đóng băng các hộp dẻo thức ăn dưới áp suất cao. Năm 1929 , tủ cấp đông
rau cải đầu tiên trên thế giới ra mắt người tiêu dùng. Thực phẩm được lưu trữ ở
những nhà lạnh ở nhiệt độ 0
0
C sẽ bảo quản trong vài tháng còn thực phẩm giữ ở
trạng thái đông lạnh tức là ở những căn phòng mà nhiệt độ được giảm từ từ cho đến
khi đạt tới -10
0
C đến -20
0
C ( nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ đóng băng của nước đá ). Ở
nhiệt độ này có thể bảo quản từ 6 tháng đến vài năm. Ở nhiệt độ thấp sự sinh trưởng
và phát triển của vi sinh vật tạm ngừng, hoạt động của các enzym bị đình chỉ, các
quá trình sinh hóa trong thực phẩm bị ức chế, nhưng nếu đem khối nguyên liệu trở
về nhiệt độ thường thì mọi hoạt động có thể được phục hồi, bởi lẽ vi sinh vật không
bị giết chết ( nhất là nấm mốc), nó chỉ giữ ở trạng thái tiềm sinh mà thôi. Do vậy
thực phẩm đông lạnh sau khi lấy ra khỏi nơi bảo quản cần được sử dụng sớm, trước
khi khối nguyên liệu tan giá.
Bảo quản thực phẩm bằng cách phơi hay sấy khô cũng là một biện pháp để
bảo quản thực phẩm. Phần lớn vi khuẩn chỉ sinh trưởng và phát triển được trong
điều kiện tối thiểu là 15%. Khi đem phơi hoặc sấy khô thực phẩm tức là làm cho độ
ẩm tối thiểu 15%. Khi đem phơi hay sấy khô thực phẩm ,tức là làm cho độ ẩm của
nguyên liệu nhỏ hơn độ ẩm tối thiểu, khiến cho các vi sinh vật gây nhiễm không thể
phát triển được. Nếu sấy hoặc phơi không kỹ, hoặc sau khi phơi, sấy bao gói không
tốt để nguyên liệu bị ẩm trở lại thì thực phẩm sẽ bị hư hỏng. Biện pháp này thường
được áp dụng đối với các loại hải sản và nấm ăn.
Bảo quản thực phẩm bằng cách tạo áp suất thẩm thấu và áp suất nén cao


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Đỗ Thị Hạnh (2006). Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic
phân lập từ nem chua để ứng dụng vào công nghệ sản xuất nem chua nhằm nâng
cao chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản. Luận văn Thạc sĩ khoa học. Đại học
Bách Khoa Hà Nội.
2. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2008). Thí nghiệm vi sinh vật thực
phẩm. Nhà xuất bản đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí
Minh. 152 trang.
3. Nguyễn Thanh Mai (2005). Nghiên cứu quy trình muối chua từ cây nha
đam, Tập san khoa học công nghệ, số 6, trang 23-25.
4. Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy (2002).
Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus plantarum L24,
Tạp chí di truyền học và ứng dụng, số 26/3/2005, trang 34.
5. Trần Linh Thước (2007). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,
thực phẩm và mĩ phẩm; Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, 230 trang.
Tài liệu tiếng anh
6. Aly S, Ouattara T, ImaeL HN, Alfred TS (2006). Bacteriocins and lactic
acid bacteria – a minireview; African Journal of Biotechnology, Vol 5, p.678-683.
7. Cleveland J, Montville TJ, Nes IF, Chikindas ML (2001). Bacteriocins:
safe, natural antimicrobials for food preservation; International Journal of Food
Microbiology, Vol 71, p.1-20.
8. Cotter PD, Hill C and Ross R (2006). Bacteriocins : Developing Innate
Immunity For Food; Nature Publishing Group, Vol 3, p.778-788.
9. Diop MB, Dauphin RD, Tine E, Ngom A (2007). Bacteriocin producers
from traditional food products; Biotechnology Agron Soc Enviromental, vol 11,
p.275-281.
10. Gálvez A, Abriouel H, López RL, Omar NB (2007). Bacteriocin-based
strategies for food biopreservation; International Journal of Food Microbiology, vol
120, p.51-70.
11. González B, Arca P, Mayo B and Suárez JE (1994). Detection,
Purification, and Partial Characterization of Plantaricin C, a Bacteriocin producted
by a Lactobacillus plantarum Strain of Dairy Origin.Applied and Enviromental
Microbiology; Vol 32, p.2158-2163.
12. Lade HS, Chitanand MP, Gyananath G & Kadam TA (2006). Studies On
Some Properties Of Bacteriocins Produced By Lactobacillus Species Isolated From
Agro-Based Waste . The Internet Journal of Microbiology, Vol 2, p.1.
13. Todorov SD, Dicks LM (2005). Characterization of bacteriocins produced
by lactic acid bacteria isolated from spoiled black olives; Journal of Basic
Microbiology, Vol 45, p.312-322.
14. Yang R, Johnson MC and Ray B (1992). Novel method to extract large
amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria. Apply Environment Microbiology,
Vol 38. p.3355-3559.