Luận Văn Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa tại huyệ

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa tại huyện Ninh Hòa-tỉnh Khánh Hòa


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . i
DANH MỤC BẢNG . iv
DANH MỤC HÌNH v
BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT . vi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN . 3
1.1. Tổng quan về Azotobacter: 3
1.1.1. Đặc điểm chung của Azotobacter: .3
1.1.2. Phân loại Azotobacter 5
1.1.3. Ảnh hưởng các nhân tố sinh thái đến sự sinh trưởng và phát triển của các
vi khuẩn Azotobacter 6
1.1.4. Quá trình cố định nitơ: 8
1.1.5. Giới thiệu về quy trình sản xuất chế phẩm cố định đạm Azotobacterin 11
1.2. Tình hình trồng lúa và sử dụng phân bón ở Việt Nam: . 12
1.2.1. Tình hình trồng lúa ở Việt Nam: 13
1.2.2. Tình hình sử dụng phân bón ở Việt Nam: 15
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Vật liệu . 20
2.1.1. Mẫu phân lập vi sinh .20
2.1.2. Thiết bị chuyên dụng .21
2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 21
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu .23
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Azotobacter từ mẫu đất .24
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính
nitrogenase mạnh 25
2.2.4. Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn
tuyển chọn 28
iii
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển
chọn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa .34
Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 36
3.1. Phân lập các chủng Azotobactertừ mẫu đất . 36
3.2. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính nitrogenase 37
3.2.1. Thử hoạt tính catalase 37
3.2.2. Xác định khả năng di động 39
3.2.3. Xác định khả năng cố định đạm bằng thuốc thử Nessler 39
3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 40
3.3.1. Xác định pH nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn .40
3.3.2 Xác định nhiệt độ nuôi cấy cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 42
3.3.3. Xác định nồng độ đường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển
chọn 43
3.3.4. Xác định nồng độ muối nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển
chọn 45
3.3.5. Nghiên cứu xác định thời gian nuôi cấy thích hợp và ảnh hưởng của thời
gian đến khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn tuyển chọn. .46
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn đến khả năng nảy mầm của
hạt lúa 49
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 51
4.1 Kết luận . 51
4.2 Kiến nghị 51
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
PHỤ LỤC . 55
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại Azotobacter . 5
Bảng 1.2: Một số mặt hàng xuất khẩu nông sản của Việt Nam 2000-2008 13
Bảng 1.3: Số lượng và giá trị gạo xuất khẩu Việt Nam qua các năm . 14
Bảng 1.4: Lượng phân bón vô cơ sử dụng ở Việt Nam qua các năm 15
Bảng 1.5: Lượng phân bón vô cơ hàng năm cây trồng chưa sử dụng được 16
Bảng 2.1: Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn . 20
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập 36
Bảng 3.2: Hoạt tính catalase của 15 chủng phân lập . 38
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 41
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 42
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 44
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 . 45
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrogenase của
chủng L8 . 46
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng L8 lên khả năng nảy mầm của hạt lúa . 49
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình dạng tế bào Azotobacter sp . 3
Hình 1.2: Sơ đồ giả thuyết về các con đường của quá trình cố định N2 . 9
Hình 2.1: Cánh đồng nơi lấy mẫu . 20
Hình 2.2: Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 23
Hình 2.3: Phương pháp phân lập vi sinh vật 25
Hình 2.4: Đường chuẩn Nessler 27
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng L8 28
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy thích hợp cho chủng L8 29
Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn
tuyển chọn . 30
Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ đường nuôi cấy thích hợp cho chủng
vi khuẩn tuyển chọn . 31
Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ muối nuôi cấy thích hợp cho chủng vi
khuẩn tuyển chọn . 32
Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho chủng vi
khuẩn tuyển chọn . 33
Hình 2.11: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn đã tuyển
chọn lên khả năng nảy mầm của hạt lúa . 35
Hình 3.1 (a): Hình thái khuẩn lạc của chủng L8 37
Hình 3.1 (b): hình thái tế bào chủng L8 dưới độ phóng đại X-1000 37
Hình 3.2(a): Hoạt tính catalase (-) .38
Hình 3.2(b): Hoạt tính catalase (+) . 38
Hình 3.3: Hoạt tính nitrogenase của 8 chủng phân lập 39
Hình 3.4. Hoạt tính nitrogenase của 8 chủng phân lập 40
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 41
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 42
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 . 44
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 . 45
Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrogenase của
chủng L8 . 47
Hình 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng L8 lên khả năng nảy mầm của hạt lúa . 49
Hình 3.11: Sự nảy mầm của hạt lúa của mẫu 0 và mẫu 2 sau 3 ngày 50
vi
BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT
DNA Deoxyribonucleic Acid
FDA Food and Drug Administration
Fuc Fucose
Gal Galactose
Man Mannose
OD Optical Density (Mật độ quang)
RNA Ribonucleic Acid
FAO Food and Agriculture Organization
ATP Adenosine triphosphat
N Nitơ
1
MỞ ĐẦU
Đạm là chất dinh dưỡng có vai trò hàng đầu đối với cây trồng. Hàm lượng
của chúng trong đất rất ít, dao động trong khoảng 4-30mg/100g đất, tùy vào loại
đất. Vì vậy cây trồng thường thiếu đạm, để cung cấp nguồn đạm cho cây trồng,
ngoài việc sử dụng phân đạm hóa học, một trong các phương pháp khác làm tăng
cường lượng đạm trong đất để cung cấp cho cây trồng đang được nhiều người quan
tâm là sử dụng các loại vi sinh vật cố định đạm từ không khí.
Hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng vẫn sử dụng phân
bón hóa học là nguồn cung cấp đạm chủ yếu và nguồn đạm này tăng nhanh trong
những năm gần đây. Theo FAO, nhu cầu sử dụng phân bón hóa học tăng lên với tốc
độ vũ bão. Năm 1905, cả thế giới mới chỉ sử dụng 1,4 triệu tấn NPK thì đến năm
1990 lượng phân bón hóa học mà thế giới sử dụng là 138 triệu tấn, năm 2000 là 144
triệu tấn, năm 2005 là 150 triệu tấn và hiện nay nhu cầu sử dụng phân bón hóa học
của thế giới lên tới 200 triệu tấn/năm. Nhu cầu sử dụng phân bón hóa học tăng
nhanh là xu thế tất yếu để đảm bảo lương thực, thực phẩm cho sự bùng nổ dân số
trên hành tinh. Tuy nhiên, việc lạm dụng phân bón hóa học đã bộc lộ mặt trái của nó
là gây ô nhiễm môi trường, làm giảm độ phì nhiêu của đất, gia tăng lượng tồn dư
chất độc lên nông sản, thực phẩm. Thực trạng này đã xảy ra phổ biến ở phạm vi
toàn cầu và trở thành nghiêm trọng ở các nước đang phát triển.
Để có thể vừa đảm bảo an ninh lương thực, vừa phải duy trì và cải thiện độ
phì nhiêu của đất canh tác, đồng thời không ngừng nâng cao chất lượng nông sản,
tăng hiệu quả kinh tế và an toàn bền vững về môi trường, các nhà khoa học và các
nhà sản xuất chuyển sang nghiên cứu nhiều về vi khuẩn cố định đạm cộng sinh, tự
do hay nội sinh để làm phân đạm sinh học bón cho cây trồng.
Phân bón vi sinh có nhiều đặc điểm nổi trội so với phân bón hóa học, ngoài
tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân bón vô cơ,
giảm chi phí sản xuất thì phân bón vi sinh còn góp phần bảo vệ môi trường và phát
triển ngành nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân bón vi sinh ở
nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp do
quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó
nghiên cứu hoàn thiện và nâng cao chất lượng của phân bón vi sinh là một việc cấp
2
thiết hiện nay. Trong đó, công tác tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các chủng vi
sinh vật là khâu đầu tiên và vô cùng quan trọng trong quy trình sản xuất chế phẩm
phân bón vi sinh.
Azotobacterlà một vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất. Chúng có khả năng
cố định đạm cao từ N2không khí và không phụ thuộc vào cây chủ, Azotobacter còn
có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm và sinh một số chất có hoạt tính sinh
hoc cao như: Thiamine, Riboflavin, Nicotine, Heteroauxin Indole acetic và
Gibberellins . chính nhờ những đặc điểm quan trọng đó mà vi khuẩn Azotobacter
được dùng rộng rãi trong các chế phẩm phân bón vi sinh làm tăng năng suất cây
trồng.
Thêm vào đó, hiện nay Việt Nam chúng ta đang là một cường quốc về xuất khẩu
gạo, cây lúa đang là cây trồng chủ lực đóng góp vào sự phát triển của xã hội, vì vậy
vấn đề phát triển ngành trồng lúa đang là một vấn đề quan trọng đối với quốc gia.
Và trong địa bàn tỉnh Khánh Hòa thì huyện Ninh Hòa được xem như là một vựa lúa
chính của cả tỉnh, hàng năm sản lượng lúa của huyện Ninh Hòa chiếm hơn 1/3 sản
lượng lúa của cả tỉnh.
Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và tuyển chọn chủng
vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa tại huyện Ninh
Hòa-tỉnh Khánh Hòa”.
1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ
đất trồng lúa tại huyện Ninh Hòa-tỉnh Khánh Hòa.
2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ nuôi cấy và pH của môi trường nuôi cấy tối ưu cho
sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
3. Nghiên cứu xác định nồng độ đường, nồng độ muối của môi trường nuôi cấy tối
ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn tuyển chọn
4. Nghiên cứu xác định thời gian nuôi cấy tối ưu và khảo sát ảnh hưởng của thời
gian đến khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuôi cấy vi khuẩn đến sự nảy mầm của hạt lúa.
Đề tài được thực hiện tại phòng Hóa phân tích và triển khai công nghệ thuộc
Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
3
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Azotobacter:
1.1.1. Đặc điểm chung của Azotobacter:
Azotobacter laø chuûng vi khuaån thöôøng ñöôïc tìm thaáy trong ñaát vaø coù taùc
duïng raát lôùn trong vieäc laøm taêng ñoä maøu môõ cho ñaát cuõng nhö laøm taêng naêng
suaát caây troàng. Azotobactertöï nhieân coá ñònh nitơtöø khoâng khí trong vuøng reã. Moãi
chuûng Azotobacter coù caùc ñaëc tính veà hoùa hoïc, sinh hoïc rieâng. Tuy nhieân moät vaøi
chuûng coù khaû naêng coá ñònh nitrogen cao hôn so vôùi caùc chuûng khaùc (Islam M.Z
và cs, 2008).
Azotobacter là vi khuẩn hình cầu, Gram (-), không sinh nha bào, hiếu khí,
sinh sản theo lối phân cắt giản đơn, lượng DNA trong tế bào Azotobacter thường ít
hơn các vi khuẩn khác (Sachin D., 2009).
Khi nuôi trong môi trường thạch, vi khuẩn Azotobactercó khuẩn lạc nhầy,
lồi hoặc tan, lúc đầu không màu, sau biến thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen,
nhưng không làm nhuộm màu môi trường khuẩn lạc. Ngoài ra một số loài
Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng.
Hình 1.1: Hình dạng tế bào Azotobacter sp
(a) dưới kính hiển vi điện tử (b) tiêu bản âm
4
Vi khuẩn Azotobacter khi còn non có tiêm mao, có khả năng di động nhờ
tiên mao , khi già tế bào mất khả năng di động, kích thước tế bào thu nhỏ lại.
Vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc dạng S màu trắng trong, lồi nhầy. Khi
già, khuẩn lạc có màu vàng lục hoặc màu nâu thẫm, tế bào được bao bọc bởi lớp vỏ
dày và tạo thành nang xác, gặp điều kiện thuận lợi, nang xác này sẽ nứt ra và tạo
thành các tế bào mới.
Vi khuẩn Azotobacter thích ứng ở pH= 7.2-8.2, ở nhiệt độ 28-30
0
C, độ ẩm
40-60%. Azotobacter đồng hóa tốt các loại đường đơn và kép, cứ tiêu tốn 1g đường
glucose nó có khả năng đồng hóa được 8-18 mg N (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002).
Noàng ñoä muoái 0.9% coù theå gaây cheát Azotobacter nhöng trong moâi tröôøng
nuoâi caáy cần thieát phaûi boå sung theâm muoái. Azotobacter coù khuynh höôùng nhaïy
caûm vôùi pH acid, noàng ñoä phosphate cao vaø nhieät ñoä cao hôn 35
o
C, Azotobacter
soáng coäng sinh trong reã cuûa moät vaøi loaøi thöïc vaät coù khaû naêng saûn xuaát ra
hormone kích thích sinh tröôûng thöïc vaät ( Islam M.Z và cs, 2008).
Ngoài khả năng cố định nitơ, Azotobacter còn có khả năng tiết ra một số
vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B6 và một số chất có hoạt tính sinh học cao
như:Indole acetic, Gibberellins và các loại kháng sinh thuộc nhóm Anixomyxin.
Khi Azotobacter ñöôïc öùng duïng trong gieo haït thì khaû naêng naûy maàm cuûa haït
taêng leân moät caùch ñaùng keå, ñoàng thôøi Azotobacter cuõng laøm taêng khaû naêng
choáng chòu saâu beänh cuûa thöïc vaät nhôø nhöõng chaát kích thích sinh tröôûng maø noù
taïo ra.
Vi khuẩn Azotobacterthuộc loại vi khuẩn sống theo phương thức dị dưỡng,
chúng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột,
acid hữu cơ, hợp chất thơm Tuy vậy nhiều tác giả cho biết không ít các chủng
Azotobacter không có khả năng đồng hóa lactose, manitol hoặc natribenzoat.
Trên các môi trường không chứa N khuẩn lạc Azotobactercó dạng nhầy, lồi,
đôi khi nhăn nheo. Chứng tỏ vi khuẩn Azotobacter có khả năng sinh trưởng trên môi
trường không có N. Sở dĩ chúng tồn tại được là vì có khả năng đồng hóa muối
5
ammonium, urê. Một số chủng Azotobactercó khả năng sử dụng nitrit, nitrat. Hai
loại acid thích hợp nhất với nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacterlà acid glutamic và
acid asparaginic (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002).
1.1.2. Phân loại Azotobacter
Chi Azotobacter chủ yếu có 4 chi:


DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Gia Huy, Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng,
Nhà xuất bản Giáo Dục.
2. Lê Văn Tiềm, Trần Công Tàu (1999), Phân tích đất cây trồng, Nhà xuất bản
Nông nghiệp.
3. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2000), Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm,
Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
4. Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh vật ( tập 1),Nhà xuất bản Đại học
quốc gia.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước,
Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương
pháp nghiên cứu vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa hoc kỹ thuật Hà Nội.
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học,
Nhà xuất bản Giáo Dục.
7. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (2002),
Công Nghệ Enzym, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
8. Aquilanti L., Favilli F., Clemanti F. (2004), “Comperison of different strategies
for isolation and preliminaru identification of Azotobacter from soil sampes”, Soil
Biology and Biochemistry, 36, 1475-1483.
9. Bhatia R., Ruppel S. (2008), “Diversity studies of Azotobacter spp from wheat
cropping systems of India”, Joural of Basic Microbiology, 48 (4), 455-463.
10. Bretrand H., Nalin H., Bally R. (2001), “Isolation and identification of the most
efficient plant growth promoting bacterio associated with canola”, Biology and
Fertility of Soil, 33, 152-156.
11. Chaway C.P, Hynes R.K, Nelson L.M (1989), “Plant growth-promoting
rhizobacteria effects on growth and nitrogen fixation of lentils and pea”, Soil
Biology and Biochemistry,21, 511-517.
53
12. Damir O., Mladen D. (2011), “Cultivation of the Bacterium Azotobacter
chroococcum for preparation of biofertilizers”, African Journal of Biotechnology,
Vol. 10(16), 3104-3111.
13. Duff J.T, Wyss O. (1961), “Isolation and classification of a new series of
Azotobacter bacteriophage”, J.gen.Microbial, 24, 273-289.
14. Gatierrez I., Torres A.B, Moreno N. (2011), “Optimising carbon and nitrogen
sources for Azotobacter chroococcum growth”, African Journal of Biotechnology,
10 (15), 2951-2958.
15. Glick B.R (1995), “The enhancement og plant growth by free-living bacteria”,
Canadian Journal of Microbiology, 41, 109-117.
16. Islam M.Z, Sharif D.I, Hossain M.A (2008), “A comparative study of
Azotobacter spp.from diffirent soil samples”, J.Soil.Nature, 2 (3), 16-19.
17. Jones I.W, Greaves J.E (1993), “Azotobacter chroococcum and its relationship
to accessory growth factory”, African Journal of Biotechnology, 5 (2), 751-763.
18. Kizilkaya R. (2008), “Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp.strain
isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the
microbiologycal properties of soils”, J.Environ. Biol, 30 (1), 73-82.
19. Kloepper J.W, Hume D.J, Scher F.M (1988), “Plant growth-promoting
rhizobacteria on canola”, Plant Disease, 72, 42-45.
20. Sachin D. (2009), “Effect of Azotobacter chroococcum (PGPR) on the Growth of
Bamboo (Bambusa bamboo) and Maize ( Zea mays) Plants”, Biofrontiers,1, 24-31.
21. Sandeep C., Rushmi S.N, Shurmila V. , Surekha R., Tejuswini R., Suresh C.K
(2011), “Growth Response of Amaranthus Gangeticus Azotobacter chroococcum
isolated from different Agroclimatic Zones Kamalaka”, Journal of Phytology, 65
(3), 56-73
22. Sarwar K., Macrac I.C (1992), “Determination of bacterially derived auxins
using a microplate method” Lett. Appl. Microbiol, (20), 282-586.
23. Shaukat et al. (2006), “Growth response of triticum aestivum to plant growth
promoting rhizobacteria used as a biofertilizers”, Reseach Journal of Microbiology,
4, 330-338.
54
24. Suliasih, Widawati S. (2005), “Isolation and identification of Phosphate
solubilizing and nitrogen fixing Bacteria from soil in Wamena Biogical Garden,
Jayawijaya, Papua”, Biodiversitas, 6, 157-177.
25. Vigyan K., Sirohi K. (2010), “Methodology of nitrogen Biofertilizer
production”, Journal of Advances in Developmental Research, 1 (1), 3-6.
* TRANG WEB
26. http://www.agroviet.gov.vn