Thạc Sĩ Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme invertase (β-fructofuranosidase) nhằm

MỞ ĐẦU
Đường là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con người. Theo thống kê, nhu cầu tiêu thụ đường trên thế giới trung bình tính theo đầu người là 35 kg/1 người/1 năm. Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 người/1 năm, hiện nay là 15 kg/1 người/1 năm và dự kiến nhu cầu về đường còn tiếp tục tăng nữa. Tại các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, 75% sản lượng đường được sản xuất từ cây mía. Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ chủ yếu đường sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn nguyên liệu ban đầu để sản xuất đường. Do đó, ở Việt Nam mía trở thành một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ. Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đường chỉ đạt mức trung bình của thế giới. Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết hợp với phương pháp lai tạo truyền thống chưa thực sự có hiệu quả trong việc tạo giống mía có hàm lượng đường cao lại phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng khí hậu của nước ta. Chọn tạo giống mía có hàm lượng đường cao bằng công nghệ sinh học có tiềm năng giảm giá thành đường mà không cần tăng diện tích trồng mía và thúc đẩy sự phát triển nền công nghiệp mía đường tại Việt Nam.
Sinh tổng hợp sucrose là một quá trình phức hợp, trong đó enzyme Invertase được xem như là một chiếc chìa khóa điều chỉnh sự tích lũy lượng sucrose trong cây mía. Nó có vai trò phân hủy sucrose trong tế bào. Vì vậy, muốn tăng trữ lượng sucrose trong cây mía thì phải ức chế được sự biểu hiện của gen mã hóa Invertase. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) hiện nay đã trở thành một biện pháp công nghệ hữu hiệu có thể ức chế hoàn toàn biểu hiện của gen ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật [31]. Ở thực vật,
RNAi có thể được thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà chứa trình tự tương đồng với gen đích.
Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lượng đường cao, chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía”.
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 3
1.1.1. Sơ lược về cây mía . 3
1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam 4
1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE . 5
1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO 8
1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHưƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) 10
1.5.1. Nguồn gốc RNAi 10
1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen 10
1.6. KỸ THUẬT GATEWAY ® . 12
1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA . 14
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16
2.1. NGUYÊN LIỆU . 16
2.1.1. Nguyên liệu thực vật 16
2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme . 16
2.1.3. Hóa chất khác 16
2.1.3. Các thiết bị máy móc . 17
2.2. PHưƠNG PHÁP . 17
2.2.1. Thiết kế mồi . 17
2.2.2. Tách RNA tổng số 18
2.2.3. RT-PCR 18
2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen . 19
2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi . 20
2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo 21
2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía . 22
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 2
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 24
3.1. THIẾT KẾ MỒI . 24
3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ 25
3.3. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE 27
3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN . 28
3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR 28
3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 28
3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR . 29
3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit 31
3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi . 31
3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway . 31
3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli . 32
3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. 34
3.7. TÁI SINH VÀ BưỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA . 35
3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo . 35
3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen . 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 42