Thạc Sĩ Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm

MỞ ĐẦU


Đường là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con người. Theo thống kê, nhu cầu tiêu thụ đường trên thế giới trung bình tính theo đầu người là 35 kg/1 người/1 năm. Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 người/1 năm, hiện nay là 15 kg/1 người/1 năm và dự kiến nhu cầu về đường còn tiếp tục tăng nữa. Tại các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, 75% sản lượng đường được sản xuất từ cây mía. Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ chủ yếu đường sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn nguyên liệu ban đầu để sản xuất đường. Do đó, ở Việt Nam mía trở thành một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ. Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đường chỉ đạt mức trung bình của thế giới. Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết hợp với phương pháp lai tạo truyền thống chưa thực sự có hiệu quả trong việc tạo giống mía có hàm lượng đường cao lại phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng khí hậu của nước ta. Chọn tạo giống mía có hàm lượng đường cao bằng công nghệ sinh học có tiềm năng giảm giá thành đường mà không cần tăng diện tích trồng mía và thúc đẩy sự phát triển nền công nghiệp mía đường tại Việt Nam.

Sinh tổng hợp sucrose là một quá trình phức hợp, trong đó enzyme Invertase được xem như là một chiếc chìa khóa điều chỉnh sự tích lũy lượng sucrose trong cây mía. Nó có vai trò phân hủy sucrose trong tế bào. Vì vậy, muốn tăng trữ lượng sucrose trong cây mía thì phải ức chế được sự biểu hiện của gen mã hóa Invertase. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) hiện nay đã trở thành một biện pháp công nghệ hữu hiệu có thể ức chế hoàn toàn biểu hiện của gen ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật [31]. Ở thực vật, RNAi có thể được thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà chứa trình tự tương đồng với gen đích.

Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lượng đường cao, chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía”.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:

Ức chế biểu hiện của Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

1. Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía in vitro

ROC1

2. Thiết kế được vector ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase (β-

fructofuranosidase) ở cây mía.

3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây mía phục vụ cho mục đích chuyển gen tiếp theo.



MỞ ĐẦU 1

MỤC LỤC

Trang


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 3

1.1.1. Sơ lược về cây mía . 3

1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam 4

1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE . 5

1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO 8

1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHưƠNG PHÁP RNAi (RNA

INTERFERENCE) 10

1.5.1. Nguồn gốc RNAi 10

1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen 10

1.6. KỸ THUẬT GATEWAY ® . 12

1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA . 14

Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16

2.1. NGUYÊN LIỆU . 16

2.1.1. Nguyên liệu thực vật 16

2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme . 16

2.1.3. Hóa chất khác 16

2.1.3. Các thiết bị máy móc . 17

2.2. PHưƠNG PHÁP . 17

2.2.1. Thiết kế mồi . 17

2.2.2. Tách RNA tổng số 18

2.2.3. RT-PCR 18

2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen . 19

2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi . 20

2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo 21

2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía . 22

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 2

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 24

3.1. THIẾT KẾ MỒI . 24

3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ 25

3.3. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE 27

3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN . 28

3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR 28

3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến

E.coli TOP 10 28

3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR . 29

3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit 31

3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi . 31

3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway . 31

3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli . 32

3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG

VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. 34

3.7. TÁI SINH VÀ BưỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA . 35

3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo . 35

3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen . 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 42



NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT


AS Acetosyringone

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin)

bp Cặp base

cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung được tổng hợp bằng

khuôn mRNA

cs Cộng sự

DEPC Diethyl pyrocarbonat

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
EtBr đEtBrEthiium bromide

E.coli Escherichia coli

gus β-glucuronidase

IBA Indole-3-Butyric Acid kb kilo base
LB Luria and Bertani

MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige và Skoog

NAA Naphthalene Acetic Acid

OD Giá trị mật độ quang (optical density)

PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase

RNA Ribonucleic Acid

RNase Ribonuclease

RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat
TAE Tris-acetate-EDTA

Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase)

2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid





Tên bảng Trang

Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm . 16

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bước . 18

Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 19

Bảng 2.4. Các môi trường tái sinh cây mía . 21

Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3’INV và

5’INV 25

Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng

gen NCBI . 25

Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro

trên các môi trường thử nghiệm M1 - M4. 36




Tên hình Trang

Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các

enzyme chính . 6

Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi 11

Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway 13

Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2

giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% . 26

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% 27

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13 (For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong
vector pENTR/D . 30

Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập được với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số AY302083 31
Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi . 32

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với

HindIII và XbaI . 34

Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong

A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV . 35

Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo 37

Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông

qua trung gian A.tumefaciens . 39