Luận Văn Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzym có khả năng cắt mạch fucoidan

Đồ án tốt nghiệp
Đề tài: PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI SINH VẬT BIỂN SINH ENZYM CÓ KHẢ NĂNG CẮT MẠCH FUCOIDAN


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN . 5
1.1. Tổng quan về rong biển . 5
1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển 5
1.1.2. Phân loại rong biển 6
1.1.3. Phân bố và ứng dụng rong Nâu trên thế giới . 6
1.1.4. Rong Mơ Việt Nam . 7
1.2. Tổng quan về enzyme . 8
1.2.1. Khái niệm chung về enzyme 8
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme . 9
1.2.3. Tính chất của enzyme . 11
1.3. Giới thiệu về Fucoidan . 14
1.3.1. Fucoidan . 14
1.3.2. Hoạt tính sinh học của Fucoidan 16
1.3.3. Ứng dụng của fucoidan và oligosacharit của nó 19
1.3.3.1. Một số ứng dụng của Fucoidan tự nhiên . 19


1.3.3.2. Một số ứng dụng của oligosaccharit từ một fucoidan . 20
1.3.3.3. Một số sản phẩm Fucoidan trên thế giới . 20
1.4. Enzyme có khả năng phân cắt fucoidan 21
1.4.1. Enzyme fucoidanase 21
1.4.2. Một số nghiên cứu về fucoidanase trên đối tượng vi sinh vật . 21
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
2.1. Chủng giống . 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật . 23
2.2.2. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 25
2.2.3. Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan . 26
2.2.4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme bẻ ngắn mạch
fucoidan 28
2.2.4.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào . 28
2.2.4.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme 28
2.2.4.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme . 28
2.2.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat tính enzyme . 28
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 29
3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật biển theo định hướng sinh enzyme cắt ngắn
mạch fucoidan . 29
3.2. Sàng lọc vi sinh vật biển theo định hướng sinh enzyme cắt ngắn mạch
fucoidan . 32
3.3. Khảo sát điều kiện tách chiết enzyme 35
3.3.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào . 35


3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạtt tính enzyme 36
3.3.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme . 36
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme . 38
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 40
4.1. Kết luận 40
4.2. Kiến nghị 41
PHỤ LỤC 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 44


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số ứng dụng của fucoidan chiết từ rong nâu. . 19
Bảng 1.2: Ứng dụng của ologosacarit từ fucoidan. 20
Bảng 1.3: Vi sinh vật biển và enzym của chúng 22
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan . 23
Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn biển đã phân lập được. 30
Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme khi lên mem vi sinh vật trên môi trường lỏng chứa
fucoidan từ rong S. mcclurei . 33
Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme khi ly tâm với tốc độ khác nhau. 35
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme. 36
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme. 37
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. . 38


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Một số loài rong có chứa fucoidan. 15
Hình 1.2: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus 16
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật biển. 24
Hình 2.2: Xử lý mẫu rong trước khi phân lập. . 25
Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật. 26
Hình 2.4: Đường chuẩn fucose. 27
Hình 3.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase 32
Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme. 37
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. 38




BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT
AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate
DNA Deoxyribonucleic acid
Ex Extract
Fuc Fucose
Gal Galactose
HGF Human Hepatocyte Growth Factor
HIV Human immunodeficiency virus
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
CE Control enzym
CS Control substrate
Man Mannose
NITRA Nha Trang Institute of Technology Rearcher and Application
Rha Rhamnose
RNA Ribonucleic acid
Xyl Xylose


MỞ ĐẦU
Với hơn 3200 km chiều dài bờ biển, nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới và
cận nhiệt đới, Việt Nam có hệ sinh thái động-thực vật thủy sinh là vô cùng đa dạng
và phong phú. Trong đó hệ thực vật tảo biển chiếm một lượng sinh khối lớn với
khoảng 1000 loài được dự đoán, 639 loài đã xác định bao gồm 151 loài rong lục,
269 loài rong đỏ, 143 loài rong nâu và 76 loài rong lam [13].
Ngay từ xa xưa nhiều loài rong tảo đã được con người sử dụng làm thức ăn
cho người và gia súc, một số nước tại vùng biển Châu Á, Châu Mỹ một số loài rong
còn được sử dụng để làm thuốc. Câu chuyện về tỉ lệ người chết thấp và tỉ lệ người
cao tuổi sống khỏe mạnh (trên 100 tuổi) khác thường ở đảo Tonga (Nam Thái Bình
Dương) vẫn hấp dẫn các nhà khoa học khi những người dân đảo này cho biết họ
sống được như vậy là nhờ rong nâu, loài thực vật mà họ đã thu hoạch và sử dụng
hơn 3000 năm nay. Người Tonga tin rằng rong nâu chính là nguồn dược liệu giúp
họ tăng tuổi thọ, sức khỏe và sinh lực. Vì một trong những lí do này mà các nhà
khoa học đã tập trung nghiên cứu vào đối tượng rong nâu và tìm ra được rất nhiều
chất có hoạt tính sinh học cao như là kháng khuẩn, kháng khối u, tăng cường khả
năng miễn dịch Đăc biệt là fucoidan được tìm thấy trong rong nâu là chất có rất
nhiều hoạt tính sinh học quý giá. Ngoài fucoidan trong rong nâu còn có nhiều hợp
chất có giá trị kinh tế như: laminaran, mannitol, gibberelin, cytokinin, auxin, iod,
khoáng, axit béo và nhiều loại vitamin.
Việt Nam có hơn 120 loài rong nâu với sản lượng ước tính trên 10000 tấn
khô/năm, nhưng đa số người dân thường thu hoạch rong này để làm phân bón và
thức ăn chăn nuôi. Thấy được tiềm năng này Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công
Nghệ Nha Trang đã triển khai nghiên cứu và sản xuất thành công fucoidan là một
hướng nghiên cứu thiết yếu cho khoa học và có giá trị thực tiễn [1],[2].
Fucoidan, một sulphat polysaccharide sinh học được chiết từ rong nâu, đặc
biệt được quan tâm nghiên cứu nhờ nhiều hoạt tính dược lý đặc biệt như chống
đông tụ, chống viêm nhiễm, điều tiết miễn dịch, ức chế sự phát triển ư bướu, kháng
ung thư và kháng virus kể cả virus HIV và hơn nữa nguồn cung cấp chủ yếu là
rong nâu tự nhiên có trữ lượng lớn tại các vùng biển nước ta.
Tuy nhiên mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của chúng vẫn
chưa được giải thích rõ ràng do cấu trúc phức tạp và không theo quy luật của
fucoidan từ các nguồn gốc loài rong khác nhau mà nó được chiết ra. Trong mạch
phân tử của chúng chứa chủ yếu các gốc fucose được sulphat hóa ở các vị trí khác
nhau và liên kết với nhau thông qua một số liên kết như (1-3) (1-4), (1-2) glycosit ít
theo quy luật. Ngoài ra trong phân tử còn có mặt một số đường đơn khác như:
galactose, manose, xylose, glucose và các mạch nhánh có chứa gốc fucosyl,
galatosyl Chính vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố cấu trúc lên
hoạt tính sinh học của fucoidan là một thách thức không nhỏ đối với các nhà khoa
học.
Điều này chỉ được giải quyết hiệu quả nhất khi sử dụng các loại enzyme có
khả năng cắt mạch fucoidan như là một công cụ để nghiên cứu cấu trúc cũng như
tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan.
Cho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra 2 loại ezyme O-glycosyl
hydrolase có hoạt tính với fucoidan đó là fucoidanase và α-L-fucosidase. Hoạt tính
của α-L-fucoisidase được mô tả dễ dàng như là sự giải phóng L-fucose khỏi đoạn
cuối của một phân tử polysaccharide, thì việc xác định hoạt tính của fucoidanase
được giải thích bởi hai kiểu bẻ gãy liên kết glycosit. Fucoidanase có thể bẻ gãy các
liên kết glusosit bên trong phân tử polysaccharide làm giảm nhanh chóng trọng
lượng phân tử (endo-fucoidanase) hoặc ở phía rìa ngoài của phân tử để lấy đi một số
phân tử oligosaccharide làm cho trọng lượng phân tử giảm từ từ (exo-fucoidanase)
[23],[46].
Do fucoidan được chiết từ các loài rong khác nhau thì khác nhau nên các
nghiên cứu về cơ chế tác động của fucoidanase còn rất hạn chế và khó để so sánh
các kết quả thực nghiệm với nhau.
Các nhà khoa học Pháp và Nhật đã công bố tìm thấy một số loại fucoidanase
từ một số loại động vật thân mềm biển như: bào ngư Haliotis sp, điệp
Pectenmaximus, động vật thân mềm Pectinidae Patinopecten Yessoensis. Các
enzyme này có khả năng thủy phân fucoidan một cách rất hiệu quả để tạo thành các
oligosaccharide [7],[8]. Tuy nhiên việc tiềm kiếm enzyme từ động vật thân mềm
biển chỉ có ý nghĩa về mặt nghiên cứu nhưng khó có thể đưa vào ứng dụng ở quy
mô sản xuất công nghiệp. Vì vậy, người ta đặc biệt quan tâm đến enzyme cắt mạch
fucoidan có nguồn gốc vi sinh vật là vì các lí do sau: thứ nhất tốc độ sinh trưởng và
sinh sản của vi sinh vật rất nhanh, enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất cao, thứ
hai có thể kiểm soát được điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật sinh tổng hợp các chất
theo định hướng của chúng ta, thứ ba nuôi cấy vi sinh vật ta có thể thu toàn bộ sinh
khối vi sinh một cách dễ dàng và ít tốn diện tích nuôi cấy. Một số nhóm các nhà
khoa học Nhật Bản [9],[10] đã phân lập được vi khuẩn có khả năng cắt mạch
fucoidan từ trầm tích biển và nước biển. Trong vài thập kỉ trở lại đây có nhiều
nghiên cứu thú vị về enzyme fucoidanase phân lập từ vi sinh vật biển được công bố.
Chẳng hạn, Sakai và cộng sự [43],[44] đã phân lập từ biển Nhật Bản vi khuẩn
Flavobateriacea có thể phân cắt nhiều loại fucoidan khác nhau được chiết từ các
loài rong Laminariales, Kiellmaniella crassifolia, Lessonia nigrescens và Undaria
pinatifida. Cho đến năm 2004, chúng tôi chưa tìm thấy một công bố nào trong nước
đề cập một cách toàn diện polysaccharide từ rong nâu Việt Nam cũng như việc cắt
mạch chúng thành oligosaccharide sử dụng enzyme từ vi sinh vật biển [1],[2].
Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên tế bào sinh vật
và tiến tới sử dụng chúng để làm dược liệu thì việc xác định cấu trúc hóa học của
chúng là điều kiện tiên quyết. Các phương pháp sử dụng hóa lý hiện nay (thủy phân,
đề-sulphat hóa, đề-actyl hóa) trước khi phân tích thường đòi hỏi điều kiện acid hoặc
kiềm mạnh ở nhiệt độ cao, do đó có thể làm thay đổi cấu trúc của polysaccharide
[7],[8],[9],[11]. Các phương pháp enzyme đặc hiệu có thể được sử dụng để điều chế
các oligosaccharide thích hợp cho các nghiên cứu sinh học cũng như các mẫu đơn
giản hóa, từ đó có thể suy luận ra cấu trúc của fucoidan ban đầu. Ngoài ra việc cắt
ngắn mạch fucoidan bằng enzyme vi sinh vật còn tạo ra các tổ hợp oligosaccharide
mới có hoạt tính sinh học đặc hiệu và hiệu lực cao hơn so với fcoidan ban đầu, đây
là xu hướng phát triển trên thế giới [22].
Chính vì vậy, trong khuôn khổ đồ án tốt nghiệp này tôi chọn đề tài nghiên
cứu là “Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme có khả năng cắt mạch
fucoidan”.
Nội dung luận văn bao gồm:
 Phân lập vi sinh vật biển theo định hướng phân cắt fucoidan.
 Sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme cắt mạch fucoidan.
 Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme
fucoidanase.



PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về rong biển
1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển
Rong biển là kho chứa gồm: thực phẩm, thuốc chữa bệnh, nguyên liệu cho
công nghiệp, nông nghiệp. Đã bao đời nay trên thế giới trong đó có Việt Nam đã và
đang sử dụng rong biển là thực phẩm trực tiếp trong bữa ăn hằng ngày.
Rong biển (marine algae) là một loại thực vật bậc thấp sống ở biển hoặc
vùng nước lợ ven biển. Sự có mặt trong thủy vực của chúng đóng hai vai trò quan
trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn và còn là nguồn cung cấp thức ăn c ho
các loài động vật ven biển [6].
Rong biển có kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước
hiển vi hoặc có khi dài hàng chục mét, hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình
sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt. Hằng năm đại dương cung cấp cho con
người khoảng 200 tỷ tấn rong. Trong 90% cacbon trên Trái Đất được tổng hợp hằng
năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó 20% từ rong biển [33],[38].
Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo như: agar, alginat,
carrageenan . dùng cho thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học .
Các polysaccharide từ rong biển được coi là những chất hữu cơ không được
thay thế trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khi được sử dụng như là chất tạo đông,
làm đặc, chất ổn nhũ và chất ổn định. Các oligosaccharide có tác dụng kháng nấm
bệnh, ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư, tế bào HIV .nhiều hợp chất
hữu cơ trong rong biển có tác dụng điều hòa kích thích sinh trưởng đối với cây
trồng nên đã được sản xuất thành phân bón hữu cơ [6].
Giá trị dinh dưỡng của rong biển là cung cấp đầy đủ các chất khoáng, các
acid amin cần thiết, các loại vitamin, các carbohydrat đặc trưng và các chất có hoạt
tính sinh học có lợi cho cơ thể và có khả năng phòng bệnh tật. Vì vậy, ngày nay
rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng và ngày càng được sử dụng rộng
rãi trên thế giới.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
[1] Bùi Minh Lý (2006), “Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất Fucoidan qui
mô pilot từ một số loài rong Nâu Việt Nam”, Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa
học công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang
[2] Bùi Minh Lý (2008), “Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất Fucoidan từ một
số loài rong Nâu Việt Nam”, Báo cáo tổng kết đề tài, Viện nghiên cứu và ứng
dụng công nghệ Nha Trang.
[3] Dặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Xuân
Sâm, Công Nghệ Enzym, Nhà Xuất Bản Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội
[4] Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sang
(2007), Tạp chí Hóa học, tập 45, số 3, trang 339-342.
[5] Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, Công
Nghệ Enzym, Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.
[6] Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa, Chế
biến rong biển, Giáo trình Đại học Nha Trang.
Tiếng anh
[7] Bakunina, I.Y., O.I. Nedashkov Shaia, S. A. Alekseeva, E. P. Ivanova, L.A.
Romanenko, N. M. Gorshkova, V. V. Isakov, T.N. Zvyagintseva, and V.V.
Mikhailov (2002), “Degradation of Fucoidan by the marine proteobacterium
Pseudoalteromonas citrea”, Microbiology, 71, 41-47.
[8] Berteau O., McCort I., Goasdoue N. et al.,(2002), “Characterization of a new
-L-fucosidase isolated from the marine mollusk Pecten maximus hat
catalyzes the hydrolysis of -L-fucose from Ascophylum nodosum”,
Glycobiology, 12, 273-282.


[9] Berteau O., Mulloy B. (2003), “Sulfated fucans and an overview of enzimes
active toward this Review”, Glycobiology B, Vol. 13, N.6, 26R-40R.
[10] Berteau O., Mulloy B., (2003), “Sulfated fucans, fresh perspectives.
Structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an
overview of enzyms active toward this class of polysaccharide”, Glycobiology,
13, 29R-40R.
[11] Bilan M. I., Grachev A. A. and Usov A. I. (2004), A highly regular fraction of
a Fucoidan from the brown seaweed Fucus distinchus, Carbonhydr. Res., 339,
511-517.
[12] Bilan M. I., Kusaykin M. I., Zvyagintseva T. N. et al. (2005), “Deistvie
ferenzymtnovo preparata iz morskovo molliuska Littorina kurila na Fucoidan
iz buroi vodorosli Fucus distichus”, Biokhimiya, 70, N.6, P. 328-338.
[13] Bo Li, Fei Lu, Xịnin Wei and Ruixiang Zhao (2008), “Fucoidan: Structure
and Bioativity”, Molecules- 13, 1671-1695.
[14] Burtseva Y. V, Kusaykin M. I, Sova V. V, et al.(2000), “Distribution of
Fucoidan hydrolases and some glycosidases among marine invertebrates”,
Russ. J. Mar. Biol., 26, 453-456.
[15] Huynh QN, Nguyen HD (1998) “The seaweed resources of Vietnam”, In:
Critchley AT, Ohno M (eds) Seaweed resources of the world. JICA. Pp 62–
69.
[16] Daisuke Tachikawa, Masaji Nakamizo, Makoto Fujii, Anti-Turmo Activity
and Enhancement of NK Cell Activity by Fucoidan, 12
th
International
Congress of Immunology and 4
th
Annual Conference of FOCIS, 2004.
[17] Daniel R., Berteau O., Chevolot L. et al. (2001), “Regiose lective desulfatation
of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk
Pecten maximus: application to the structrural study of algal Fucoidan (A.
nodosum)”, Eur. J. Biochem, 4, 55-62.


[18] Daniel R., Berteau O., Jozefonvicz J., et al. (1999), “Degradation of algal
(Ascophyllum nodosum) Fucoidan by an enzymatic activity contained in
digestive glands of the marine mollusk Pecten maximus”, Carbonhyd. Res.,
322, 291-297.
[19] Dararad Choosawad, Ureporn Leggat, Chavaboon Dechsukhum, Amornrat
Phongdara and Wilaiwan Chotigeat (2005), “Anti-turn our activities of
Fucoidan from aquatic plant Utricularia aurea lour”, SongklanakarinJ.Sei.
Technol., 27, 779-807.
[20] Descamps V., Klarszinsky O., Barbeyron J. et al. (1998), “Fuco-oligosaccharides, enzym pour leur preparation a partir de fucanes, bacterie
productricede l’enzym et application des fuco-oligosaccharides a la protection
des plantes”, Brevet, FR 2783523.
[21] Dobashi, K.; Nishino, T.; Fujihara, M. (1989), “Isolation and preliminary
characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides with blood-anticoagulant activity from seaweed Hizikia fusiforme”, Carbohydr. Res., 194,
315-320.
[22] Ellouali M., Boisson-Vidal C., Durand P. et al. (1993), “Antitumour activit y of
low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophylum
nodosum”, Anticancer Res., 13, 2011-2019.
[23] Furukawa S, Fujikawa T, Koga D, Ide A (1992), “Production of Fucoidan-degrading enzyms, Fucoidanase and Fucoidan sulfatase by Vibrio sp. N-5”,
Nippon Suisan Gakkaishi, 58, 1499–1503.
[24] Furukawas and Fujikawa T. (1984), “Growth and Fucoidan sulfatase
production in Fucoidan-utilizing bacteria from sea sand, Nippom Nogeik
Kaishi, 11, 1123-1126.
[25] Kim, Woo-Jung, Sung-Min Kim and et, “Isolation and characteriazation of
marine bacteria strains degrading Fucoidan from korea Undaria pinnatifida
sporophylls”. J.Microbiol. Biotechol.


[26] Kitamura K, Matsuo M, Yasui T (1992), “Enzymic degradation of Fucoidan
by Fucoidanase from the hepatopancreas of Patinopecten yessoensis”, Biosci
Biotechnol Biochem, 56, 490–494
[27] Kloareg, B., Dematry, M., and Mbeau, S (1986), “Polyanionic characteristic of
furified sulphated homofucans from brown algae”. Int.J.Bio Macromol-8,pp
380-386.
[28] Kobayashi T, Honke K, Miyazaki T, Matsumota K, Nakamura T, Ishizuka I,
Makita A (1994), “Hepatocyte growth factor (HGF) specifically binds to
sulfoglycolipids”, J.Biol chem-269, pp9817-9821
[29] L.loyd P. F., Lloyd K. O. (1963), “Sulfatases and sulfated polysaccharide in
the vicera of marine mollusk”, Nature, 199, 287-288.
[30] Maria E.R. Duarte,a Marc A. Cardoso,a Miguel D. Noseda,a,1 Alberto S.
Cerezo (2001), “Structural studies on Fucoidans from the brown seaweed
Sargassum stenophyllum”, Carbohydrate Research 333, pp 281–293
[31] Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Alexander S. Shashkov, Nikolay E,
Nifantiev and Anatolii I. Usov (2006) “Structure of a Fucoidan from the
brown seaweed Fucus serratus L”, Carbohydrate Research 341, pp 238-245
[32] Maruyama, Hiroko, Tâmuchi, Hidekazu; Hashimota, Minoru; Makano,
Takahisa (2003), “Antitumor activity and immune response of Mekabu
Fucoidan extracted from sporophyll of Undaria pinnatifida”, In Vivo, 17(3),
245-249.
[33] Merrill JE, Waaland JR (1998), “The seaweed resources of the United State of
America”. In: Seaweed resources of the world. JICA, pp. 303-323.
[34] Morigana T, Araki T, Ito M, Kitamikado M (1981), “A search for Fucoidan-degrading bacteria in coastal sea environments of Japan”, Bull Jpn Soc Sci
Fish, 47, 621–625.


[35] Mülheim an der Ruhr (2009), “Isolation, Characterisation, Modification an
Application of Fucoidan from Fucus vesiculosu”.
[36] Nelson TE (1944),“A photometric adaptation of the Somogy method for the
determination of glucose”, J. Biol. Chem. 153: 375–381.
[37] Nishino, T.; Yokoyama, G.; Dobahi, K. (1989), “Isolation, purification and
characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides from the brown
seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities”,
Carbohydr. Res., 186, 119-129.
[38] Ohno M., A. T. Critchley (1997), “Seaweed cultivation and marine ranching”,
Bull. Mar. Sci. Fish
[39] Pearce-Pratt R, et al.(1996), “Sulfated polysaccharides inhibit lymphocyte to
epithelial transmissio of human immunodeficiency virus”, Biological
Reproduction, 54, 173-82.
[40] Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B. (2003), “Fucoidans from the
brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity
and structural studies”. Carbohydr. Res., 338, 153-165.
[41] Régis Daniel, Olivier Berteau, Jacqueline Jozefonvicz and Nicole Goasdoue
(1999), “Degradation of algal (Ascophyllum nodosum) Fucoidan by an
enzymatic activity cantained in digestive glands of the marine mollusc Pecten
maximus”, Carbohydtate Research, Volume 322, Issues 3-4, 12 December, pp
291-297
[42] Rita Elkins M.H (2001), “Limu Moui-prize sea plant of tonga and the south
pacific”, Woodland Publishing-Utah-USA 32 pagine
[43] Rosa María Rodríguez Jasso 1, Cristobal Noé Aguilar Gonzalez 2, Lorenzo
Pastrana 3, Jose A. Couto Teixeira 1, “Identification and evaluation of fungal
strains with Fucoidan degradation potential”, Proceedings of the 10th