Thạc Sĩ Phân lập và sàng lọc các chủng Trichoderma có lợi từ hai vườn quốc gia Bù Gia Mập và Lò Gò Xa Mát

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
năm 2012

MỤC LỤC

Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục
Danh mục các bảng i
Danh mục các hình . iii
Danh mục các biểu đồ iv
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi
ĐẶT VẤN ĐỀ .1
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3

1.1. Trichoderma 3
1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các loài Trichoderma spp. .4
1.2.1. Môi trường sống .4
1.2.2. Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh 5
1.3. Ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái lên sự sinh trưởng của Trichoderma 6
1.4. Các cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma . 7
1.4.1. Ký sinh nấm (mycoparasitism) 7
1.4.2. Kháng sinh (antibiosis) .8
1.4.3. Cạnh tranh (competition) 9
1.5.1. Chitinase .11
1.5.2. Glucanase .11
1.5.3. Protease .12
1.5.4. Cellulase, Xylanase và các hệ enzyme thủy phân khác .13
1.6. Định danh Trichoderma bằng sinh học phân tử 14
1.7. Một số nghiên cứu về Trichoderma tại Việt Nam 16
1.8. Địa điểm thu nhận các mẫu đất nghiên cứu 18
1.8.1. Vườn quốc gia Bù Gia Mập .18
1.8.1.1. Vị trí địa lý 18
1.8.1.2. Diện tích 18
1.8.1.3. Đa dạng sinh học về tài nguyên sinh vật .18
1.8.2. Vườn quốc gia Lò Gò Xa Mát 19
1.8.2.1. Vị trí địa lý 19
1.8.2.2. Địa hình-địa mạo .20
1.8.2.3. Địa chất-thổ nhưỡng 20
1.8.2.4. Đa dạng sinh học về tài nguyên sinh vật .20

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1. Vật liệu .22
2.2. Phương pháp 23

2.2.3. Giữ giống Trichoderma 24
2.2.4. Định danh Trichoderma bằng sinh học phân tử .24
2.2.5. Khảo sát hoạt độ một số enzyme thủy phân của các chủng Trichoderma, bao gồm chitinase, beta-glucanase, cellulase, xylanase, mannanase, amylase và protease, dựa trên vòng phân giải cơ chất đặc
hiệu .26
2.2.6. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với một số
loài nấm gây bệnh cây trồng .26
2.2.7. Xử lý, tổng hợp số liệu .27

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1. Thu thập các mẫu đất từ hai vườn quốc gia Bù Gia Mập và Lò Gò Xa Mát 29
3.2. Phân lập các chủng Trichoderma 31
3.3. Định danh một số chủng Trichoderma dựa trên vùng trình tự bảo tồn ITS1-5.8S-ITS2 .36
3.4. Đánh giá khả năng phân hủy chất hữu cơ của các chủng Trichoderma dựa vào khả năng sinh tổng hợp một số enzyme thủy phân trên môi trường cơ chất đặc hiệu 38
3.4.1. Hoạt độ chitinase 39
3.4.2. Hoạt độ β-glucanase .40
3.4.3. Hoạt độ cellulase 41
3.4.4. Hoạt độ xylanase 42

3.4.7. Hoạt độ protease .44
3.4.8. Chọn lựa các chủng Trichoderma có tiềm năng sinh tổng hợp các hệ enzyme thủy phân hoạt độ cao .45
3.4.9. Khảo sát mối tương quan về hoạt độ trung bình giữa các hệ enzyme phân giải polysaccharid 46
3.5. Đánh giá khả năng đối kháng của Trichoderma đối với một số loài nấm gây
bệnh cây trồng điển hình .47
3.5.1. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Sclerotium rolfsii 47
3.5.2. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Rhizoctonia solani 48
3.5.3. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Phytophthora capsici .49
3.5.4. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Fusarium sp 50
3.5.5. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Colletotrichum sp. 51
3.5.6. Khả năng đối kháng của Trichoderma đối với Pythium sp. .52

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .55

4.1. Kết luận .55
4.2. Đề nghị 56

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
PHỤ LỤC 74



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Sơ lược đặc điểm hình thái khuẩn lạc đặc trưng của 47 chủng
Trichoderma phân lập trên môi trường PDA .32
Bảng 3.2. Danh sách định danh loài Trichoderma dựa vào trình tự vùng bảo tồn
ITS1-5.8S-ITS2 36
Bảng 3.3. Đường kính vòng phân giải của 4 chủng Trichoderma cao nhất trên
nguồn cơ chất chitin huyền phù 39
Bảng 3.4. Đường kính vòng phân giải của 5 chủng Trichoderma cao nhất trên
nguồn cơ chất β-glucan .40
Bảng 3.5. Đường kính vòng phân giải của 5 chủng Trichoderma cao nhất trên
nguồn cơ chất carboxymethyl cellulose .41
Bảng 3.6. Đường kính vòng phân giải của 6 chủng Trichoderma cao nhất trên
nguồn cơ chất xylan 42
Bảng 3.7. Đường kính vòng phân giải của 7 chủng Trichoderma cao nhất trên
nguồn cơ chất guargum 43
Bảng 3.8. Đường kính vòng phân giải của 2 chủng Trichoderma L5 và L7 trên
nguồn cơ chất tinh bột .44
Bảng 3.9. Đường kính vòng phân giải của 2 chủng Trichoderma cao nhất trên
nguồn cơ chất gelatin 45
Bảng 3.10. Hoạt tính cellulase, chitinase, β-glucanase, xylanase, mannanase, protease của các chủng Trichoderma có tổ hợp hoạt tính các enzyme cao .46

Bảng 3.11. Mức độ đối kháng đối với tất cả 6 loài nấm bệnh của các chủng
Trichoderma đối kháng mạnh nhất .54


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Khuẩn lạc đặc trưng của Trichoderma trên môi trường PDA và khuẩn
ty và cơ quan sinh bào tử của chúng . 3
Hình 1.2. Những hoạt động thúc đẩy sự tăng trưởng cây trồng của Trichoderma
spp. .10
Hình 1.3. Sơ đồ vùng rDNA-ITS của nấm .15
Hình 1.4. Bản đồ hiện trạng thảm thực vật hai vườn quốc gia Gia Bù Gia Mập
và Lò Gò Xa Mát .21
Hình 2.1. Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp .25
Hình 3.1. Các địa điểm thu nhận mẫu đất tại hai VQG Bù Gia Mập và Lò Gò Xa
Mát 31
Hình 3.2. Hình ảnh sơ bộ định danh bằng phòng ẩm của một số chủng
Trichoderma phân lập được .36
Hình 3.3. Sơ đồ cây phát sinh loài của 13 chủng Trichoderma phân lập dựa vào
trình tự vùng bảo tồn ITS1-5.8S-ITS2 .37
Hình 3.4. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Sclerotium rolfsii 47
Hình 3.5. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Rhizoctonia solani 48
Hình 3.6. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phytophthora capsici 49
Hình 3.7. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Fusarium sp. .50
Hình 3.8. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Colletotrichum sp. 51
Hình 3.9. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Pythium sp. .52


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ


Biểu đồ 3.1. Hoạt độ chitinase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy
trên môi trường TSM có bổ sung 1% chitin huyền phù 39
Biểu đồ 3.2. Hoạt độ β-glucanase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi
cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% β-glucan .40
Biểu đồ 3.3. Hoạt độ cellulase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy
trên môi trường TSM có bổ sung 1% carboxymethyl cellulose 41
Biểu đồ 3.4. Hoạt độ xylanase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy
trên môi trường TSM có bổ sung 1% xylan 42
Biểu đồ 3.5. Hoạt độ mannanase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi
cấy trên môi trường TSM có bổ sung 1% guargum .43
Biểu đồ 3.6. Hoạt độ amylase của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy
trên môi trường TSM có bổ sung 1% tinh bột .44
Biểu đồ 3.7. Hoạt độ protease của các chủng Trichoderma sau 48 giờ nuôi cấy
trên môi trường TSM có bổ sung 1% gelatin 44
Biểu đồ 3.8. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma đối với Sclerotium
rolfsii 48
Biểu đồ 3.9. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma đối với
Rhizoctonia solani 49
Biểu đồ 3.10. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma với Phytophthora
capsici 50
Biểu đồ 3.11. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma với Fusarium sp. 51

Biểu đồ 3.12. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma với Colletotrichum sp. .52
Biểu đồ 3.13. Mức độ đối kháng của các chủng Trichoderma với Pythium sp 53


ĐẶT VẤN ĐỀ

Hơn 40 năm qua, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học được sử dụng rộng rãi nhằm kiểm soát các loài gây hại cây trồng [117, 60, 105]. Tuy nhiên, việc sử dụng chúng trong nông nghiệp đã và đang gây ra một số tác động xấu, như ô nhiễm môi trường, làm giảm mật độ quần thể các vi sinh vật có ích và ảnh hưởng tới sức khỏe con người [17, 23, 107, 116].

Nghiên cứu kiểm soát sinh học đối với các mầm bệnh cây trồng trong đất được đề xuất từ những năm 1930 [125], với việc sử dụng các sinh vật sống thay cho thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học nhằm hạn chế những nguy cơ về môi sinh [64, 97]. Nhiều loài vi sinh vật đất được xem là những tác nhân kiểm soát sinh học đầy tiềm năng, trong đó vi nấm trong đất được chứng minh có khả năng ức chế các mầm bệnh cây trồng thông qua nhiều cơ chế như kháng sinh, ký sinh hay cạnh tranh [102, 103, 107].

Trichoderma được quan tâm nghiên cứu nhiều trong số các nấm đối kháng vì chúng hiện diện ở hầu khắp các loại đất trên thế giới [57] và có khả năng đối kháng hiệu quả với các mầm bệnh cây trồng [125]. Tuy nhiên, tính đa dạng di truyền của giống nấm này rất cao nên lợi ích của chúng trong các ngành nông-công nghiệp vẫn chưa được khai thác đầy đủ [95].

Hiện nay, xu hướng nông nghiệp hữu cơ với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh làm phân bón đang ngày càng khẳng định vị trí của mình nhằm mang lại nền nông nghiệp hữu cơ, xanh, bền vững và thân thiện với môi trường. Trong đó, Trichoderma là giống nấm đối kháng được ứng dụng nhiều trong việc sản xuất các loại chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ vi sinh, với hơn 100 sản phẩm và có khoảng 60 quốc gia đã và đang sử dụng các sản phẩm này nhằm bảo vệ cây trồng trong các điều kiện sản xuất khác nhau [95]. Thậm chí ở một số nước, như Venezuela và Cuba, việc phát triển và sử dụng các sản phẩm từ Trichoderma còn được hỗ trợ và đề nghị chính thức từ Chính phủ [71].


Trong khi đó ở Việt Nam, Trichoderma chỉ mới bắt đầu được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1987 [6], nhằm ứng dụng khả năng đối kháng của chúng vào sản xuất nông nghiệp. Cho đến nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều dòng sản phẩm phân bón hữu cơ vi sinh từ Trichoderma, như BIOPROMOT, TRICHO, TriB1, TRICÔ- ĐHCT, Vi-ĐK, BIMA, Trong đó, một số chủng Trichoderma dùng sản xuất các sản phẩm này được phân lập tại Việt Nam, nhưng cũng có những sản phẩm sử dụng các chủng giống có nguồn gốc ngoại nhập, do đó sẽ có những hạn chế nhất định về việc thích nghi với các điều kiện sản xuất thực tiễn ở Việt Nam. Do vậy, nghiên cứu“Phân lập và sàng lọc các chủng Trichoderma có lợi từ hai vườn quốc gia Bù Gia Mập và Lò Gò Xa Mát” được thực hiện nhằm sưu tập các chủng Trichoderma có tính bản địa từ hai vườn quốc gia nói trên, từ đó tiến hành sàng lọc các chủng tiềm năng trong việc phân giải chất hữu cơ, xác bã thực vật và phòng, trị một số nấm gây bệnh cây trồng nhằm phát triển thành các sản phẩm dùng trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân lập, định danh sơ bộ theo hình thái và bảo quản các chủng Trichoderma từ các mẫu đất thu thập tại hai vườn quốc gia Bù Gia Mập và Lò Gò Xa Mát.
- Định danh một số chủng Trichoderma bằng sinh học phân tử.
- Khảo sát hoạt độ một số hệ enzyme thủy phân ngoại bào (chitinase, beta- glucanase, cellulase, xylanase, mannanase, amylase và protease) của các chủng Trichoderma phân lập, từ đó sàng lọc một số chủng Trichoderma tiềm năng trong việc phân giải chất hữu cơ, xác bã thực vật.
- Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma phân lập với một số nấm gây bệnh cây trồng (Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, Fusarium sp., Pythium sp. và Colletotrichum sp.), từ đó sàng lọc một số chủng Trichoderma tiềm năng trong việc phòng, trị một số nấm gây bệnh cây trồng.