Tiến Sĩ Phân lập và khảo sát các đặt tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên

vii
MỤC LỤC

TÓM TẮT . ii
ABSTRACT . iv
MỤC LỤC vii
DANH SÁCH BẢNG xi
DANH SÁCH HÌNH . xiv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . xvi
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục tiêu 2
1.3. Nội dung nghiên cứu . 2
1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3
1.5. Những đóng góp mới của luận án . 3
1.6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án 3
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 5
2.1. Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất lúa của tỉnh Phú Yên . 5
2.1.1. Điều kiện tự nhiên của tỉnh Phú Yên . 5
2.1.2. Tình hình sản xuất lúa ở tỉnh Phú Yên 6
2.2. Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên 7
2.2.1. Hiện trạng sử dụng phân bón hóa học ở Việt Nam, Phú Yên và hiệu
suất sử dụng phân bón hóa học . 7
2.2.1.1. Ở Việt Nam . 7
2.2.1.2. Ở Phú Yên . 8
2.2.1.3. Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học hiện nay và các nguyên nhân
làm tổn thất lượng phân bón 9
2.2.2. Phân bón hữu cơ 11
2.2.3. Phân hữu cơ - vi sinh . 12
2.2.4. Phân vi sinh 12
2.2.4.1. Khái niệm phân vi sinh . 12
2.2.4.2. Tình hình nghiên cứu phân bón vi sinh ở Việt Nam 12
2.3. Vai trò của phân bón đối với cây lúa 15
2.3.1. Vai trò của phân đạm đối với cây lúa 15
2.3.2. Vai trò của phân lân đối với cây lúa 15
2.3.3. Vai trò của phân kali đối với cây lúa . 16
2.4. Tổng quan về vi khuẩn nội sinh 16
2.4.1. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật 17
2.4.2. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa 20
2.4.3. Đặc điểm của vi khuẩn nội sinh thực vật - ở cây lúa . 22 viii
2.4.4. Vai trò của vi khuẩn nội sinh . 24
2.4.4.1. Khả năng cố định đạm 24
2.4.4.2. Khả năng hòa tan lân khó tan . 26
2.4.4.3. Khả năng tổng hợp IAA 28
2.4.4.4. Đối kháng sinh học . 29
2.4.5. Những nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật trong sản
xuất phân vi sinh 31
2.4.5.1. Phân vi sinh cố định đạm 31
2.4.5.2. Phân vi sinh hòa tan lân khó tan . 33
2.4.5.3. Phân vi sinh kích thích, điều hoà sinh trưởng thực vật . 35
2.4.5.4. Phân vi sinh đa chức năng 35
CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 37
3.1. Phương tiện nghiên cứu 37
3.1.1. Vật liệu . 37
3.1.2. Dụng cụ 37
3.1.3. Thiết bị . 37
3.1.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn . 38
3.2. Phương pháp nghiên cứu 41
3.2.1. Thu mẫu lúa . 42
3.2.2. Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa 43
3.2.3. Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn. . 44
3.2.4. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR . 45
3.2.5. Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa . 46
3.2.6. Tuyển chọn vi khuẩn nội sinh 50
3.2.6.1. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi
khuẩn nội sinh 50
3.2.6.2. Đo lượng Acethylen bị khử . 51
3.2.6.3. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các
dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa trồng trong ống nghiệm . 53
3.2.6.4. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn 55
3.2.6.5. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các
dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong nhà lưới 55
3.2.6.6. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các
dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng 59
3.2.6.7. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi kết hợp
2 dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa . 61
3.3. Xử lý số liệu 63

ix
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 64
4.1. Phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng
trên đất ở tỉnh Phú Yên 64
4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn 64
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập . 66
4.2. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR 69
4.3. Kết quả khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa 69
4.3.1. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH 4
+ của các dòng vi khuẩn . 70
4.3.2. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn 72
4.3.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn 74
4.4. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của 90 dòng vi khuẩn
nội sinh có khả năng tổng hợp NH 4
+ cao, hòa tan lân và tổng hợp IAA . 76
4.5. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử và nhận diện gen nifH của
các dòng vi khuẩn được tuyển chọn 90
4.5.1. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử của các dòng vi khuẩn 90
4.5.2. Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn được tuyển chọn . 92
4.6. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn
nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm 93
4.6.1. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn . 93
4.6.2. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn 95
4.7. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn được tuyển
chọn 98
4.8. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh
trên cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới 102
4.8.1. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính
sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới . 102
4.8.2. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính
sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới 114
4.9. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh
trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 121
4.9.1. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa
học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện
ngoài đồng 121
4.9.2. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học
lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài
đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa . 128
4.10. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2
dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới và
ngoài đồng . 135 x
4.10.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2
dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới . 135
4.10.2. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung
kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng 139
4.10.2.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết
hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở ngoài đồng tại huyện Đông Hòa 139
4.10.2.2. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết
hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 trên cây lúa trồng ở ngoài đồng tại
huyện Tuy An .145
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 153
5.1. Kết luận . 153
5.2. Đề xuất 153
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .155
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 156
PHỤ LỤC 173
xi
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa các huyện, thị xã và thành
phố năm 2014 . 7
Bảng 2.2. Nhu cầu và khả năng cung ứng phân bón năm 2011 8
Bảng 2.3. Tổng lượng phân bón hóa học trong sản xuất nông nghiệp ở Phú
Yên . 8
Bảng 2.4. Một số giống vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân vi sinh ở
Việt Nam 14
Bảng 2.5. Vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây lúa . 20
Bảng 3.1. Công thức môi trường LGI 38
Bảng 3.2. Công thức môi trường Nfb 38
Bảng 3.3. Công thức môi trường Burk không đạm 40
Bảng 3.4. Công thức môi trường NBRIP lỏng . 40
Bảng 3.5. Công thức của môi trường dinh dưỡng Yoshida . 41
Bảng 3.6. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR . 45
Bảng 3.7. Các giai đoạn của phản ứng PCR 46
Bảng 3.8. Thành phần của dãy đường chuẩn NH 4
+ 47
Bảng 3.9. Thành phần của dãy đường chuẩn P 2 O 5 . 48
Bảng 3.10. Thành phần của dãy đường chuẩn IAA 50
Bảng 3.11. Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm . 54
Bảng 3.12. Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó
tan . 54
Bảng 3.13. Đặc tính đất thí nghiệm trong chậu của tỉnh Phú Yên . 56
Bảng 3.14. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát đạm . 56
Bảng 3.15. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát lân . 58
Bảng 3.16. Đặc tính đất thí nghiệm khảo sát đạm trồng lúa ngoài đồng tại
phường Phú Thạnh 59
Bảng 3.17. Đặc tính đất thí nghiệm khảo sát lân trồng lúa ngoài đồng tại
phường Phú Thạnh 61
Bảng 3.18. Các nghiệm thức trong thí nghiệm tổ hợp 2 dòng vi khuẩn . 62
Bảng 3.19. Đặc tính đất thí nghiệm ngoài đồng ở huyện Đông Hòa 62
Bảng 3.20. Đặc tính đất thí nghiệm ngoài đồng ở huyện Tuy An 62
Bảng 4.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập từ trong cây lúa 65
Bảng 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn 66
Bảng 4.3. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn 68
Bảng 4.4. Hàm lượng NH 4
+ , P 2 O 5 và IAA của 90 dòng vi khuẩn được phân
lập trên môi trường LGI, Nfb và RMR 77 xii
Bảng 4.5. Mối tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn phân lập với
các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S
rDNA . 79
Bảng 4.6. Sự đa dạng của trình tự Nucleotide được phân tích trong phần
mềm DNASP 5.10 . 89
Bảng 4.7. Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 40 dòng vi khuẩn . 90
Bảng 4.8. Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 22 dòng vi khuẩn bổ
sung lên cây lúa 92
Bảng 4.9. Chiều cao cây và trọng lượng khô cây lúa 28 NSKG trong ống
nghiệm ở thí nghiệm khảo sát đạm . 94
Bảng 4.10. Chiều cao cây và trọng lượng khô cây lúa 28 NSKG trong ống
nghiệm ở thí nghiệm khảo sát lân . 96
Bảng 4.11. Đặc tính sinh lý sinh hóa của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng nội
sinh cây lúa 99
Bảng 4.12. Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Bacillus . 100
Bảng 4.13. Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Azospirillum 101
Bảng 4.14. Đặc điểm của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn 102
Bảng 4.15. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc
tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa ở giai đoạn 48 NSKG trồng
trong chậu 104
Bảng 4.16. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc
tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa lúc thu hoạch (110 NSKG) trồng
trong chậu 108
Bảng 4.17. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên
thành phần năng suất của cây lúa lúc thu hoạch (110 NSKG) trồng trong
chậu . 110
Bảng 4.18. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân học lên đặc tính
sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong chậu ở giai đoạn 48
NSKG 116
Bảng 4.19. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc
tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong chậu lúc thu hoạch 117
Bảng 4.20. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên thành
phần năng suất của cây lúa trồng trong chậu lúc thu hoạch (110 NSKG) . 119
Bảng 4.21. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm
hóa học lên đặc tính sinh trưởng của cây lúa trồng ngoài đồng ở phường
Phú Thạnh, Tuy Hòa . 122
Bảng 4.22. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm
hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ngoài đồng ở
phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 124 xiii
Bảng 4.23. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm
hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo 126
Bảng 4.24. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa
học lên đặc tính sinh trưởng của cây lúa trồng ở phường Phú Thạnh, Tuy
Hòa . 129
Bảng 4.25. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa
học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở phường Phú Thạnh,
Tuy Hòa 130
Bảng 4.26. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa
học lên hàm lượng N trong gạo và protein trong gạo . 132
Bảng 4.27. Ảnh hưởng của vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân lên hàm
lượng P trong rơm và trong gạo 133
Bảng 4.28. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa trồng ở nhà lưới . 136
Bảng 4.29. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
lân hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa trồng ở nhà lưới . 137
Bảng 4.30. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa trồng ngoài đồng tại
huyện Đông Hòa .140
Bảng 4.31. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện Đông
Hòa . 141
Bảng 4.32. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong
gạo . 143
Bảng 4.33. Hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
phân lân hóa học lên hàm lượng P trong gạo, trong rơm 144
Bảng 4.34. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của lúa trồng ở huyện Tuy
An .146
Bảng 4.35. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện
Tuy An 147
Bảng 4.36. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân
đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein
trong gạo 149
Bảng 4.37. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,
phân lân hóa học lên hàm lượng P trong gạo, trong rơm 150
xiv
DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1. Các huyện ở tỉnh Phú Yên . 5
Hình 2.2. Cơ chế xâm nhiễm vi khuẩn nội sinh thực vật 17
Hình 2.3. Vi khuẩn Herbaspirillum xâm nhập vào cây lúa . 23
Hình 2.4. Cấu trúc enzyme Nitrogenase 25
Hình 2.5. Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N 2 25
Hình 2.6. Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học . 26
Hình 3.1. Sơ đồ tóm tắt các nội dung thí nghiệm 42
Hình 3.2. Sơ đồ các bước khử mẫu 43
Hình 3.3. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo
NH 4
+ với thuốc thử . 47
Hình 3.4. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo
P 2 O 5 49
Hình 3.5. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo
IAA 50
Hình 4.1. Vòng pellicle xuất hiện trên các môi trường nuôi cấy . 66
Hình 4.2. Hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập môi trường
LGI, Nfb và RMR . 67
Hình 4.3. Hình tế bào vi khuẩn chụp dưới kính hiển vi điện tử (SEM) độ
phóng đại 14.000 lần . 68
Hình 4.4. Nhuộm gram tế bào vi khuẩn độ phóng đại 400 lần 68
Hình 4.5. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng
vi khuẩn phân lập với 2 mồi p515FPL và p13B . 69
Hình 4.6. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn TAL4 sau 2 ngày cấy trên môi trường
Burk không đạm . 70
Hình 4.7. Sự biến thiên hàm lượng NH 4
+ của 533 dòng vi khuẩn theo thời
gian . 71
Hình 4.8. Sự biến thiên hàm lượng P 2 O 5 của 457 dòng vi khuẩn theo thời
gian . 74
Hình 4.9. Sự biến thiên hàm lượng IAA của 457 dòng vi khuẩn theo thời
gian . 75
Hình 4.10. Đa dạng về loài của 90 dòng vi khuẩn nội sinh . 81
Hình 4.11.A. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với
các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacilli có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa
vào trình tự 16S rDNA .83

xv
Hình 4.11.B. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với
các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Betaproteobacteria có trong ngân hàng gen
(NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA .84
Hình 4.11.C. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với
các dòng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter có trong ngân hàng gen (NCBI)
dựa vào trình tự 16S rDNA 85
Hình 4.11.D. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh
với các dòng vi khuẩn thuộc chi Pantoea và Pseudomonas có trong ngân
hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA 86
Hình 4.11.E. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh
với các dòng vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter, Stenotrophomonas,
Aeromonas, Erwinia và Klebsiella có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa
vào trình tự 16S rDNA 87
Hình 4.11.F. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh
với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacteroides có trong ngân hàng gen
(NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA . 88
Hình 4.12. Mối tương quan giữa hàm lượng NH 4
+ (mg/l) và hoạt tính
Nitrogenase trong dung dịch Burk (µmol) .91
Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 dòng vi khuẩn nội sinh trên
gel agarose 93
Hình 4.14. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn ảnh hưởng lên sự sinh
trưởng của cây lúa 28 NSKG .95
Hình 4.15. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên sự cây lúa 28
NSKG .97
Hình 4.16. Hình vi khuẩn TAL1 dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 99
Hình 4.17. Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM) . 100
Hình 4.18. Hình vi khuẩn dòng SHL70 dưới kính hiển vi điện tử (SEM) . 101
Hình 4.19. Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM) . 102
Hình 4.20. Chiều cao của cây lúa ở các nghiệm thức 0N trong giai đoạn 48
NSKG . 106
Hình 4.21. Bông lúa khi thu hoạch . 113
Hình 4.22. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 2 dòng vi khuẩn 135





xvi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

16S-rDNA 16S-ribosomal DNA coding gene
ARA Acetylene Reduction Assay
ATP Adenosine triphosphate
Blast N Basic local alignment search tool Nucleotid
ĐC Đối chứng
FAME Fatty acid methyl ester
FAO Food and Agriculture of Organisation
GC Gas Chromatography
Gen Nif Nitrogen fixing gene
IAA Indole acetic acid
IFA International Fertilizer industry Association
ML Ma lâm
MT Môi trường
NCBI National centre for biotechnology information
NSKC Ngày sau khi cấy
NSKG Ngày sau khi gieo
PGPR Plant growth promoting Rhizobacteria
PCR Polymerase chain reaction
PSB Phosphate solubilizing bacteria
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SEM Scanning electron microscope
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
TL Trọng lượng
TLHC Tỷ lệ hạt chắc
Trp Tryptophan
VK Vi khuẩn
VTCC Vietnam Type Culture Collection 1
CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Nhu cầu lương thực ngày càng tăng là do áp lực của sự gia tăng dân số
và lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho hơn
40% dân số thế giới. Trong năm 2014, sản lượng lúa trên thế giới đạt 741 triệu
tấn (FAO, 2015). Năng suất cũng như sản lượng lúa tùy thuộc vào khí hậu,
loại đất, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng. Cây lúa cần nhiều chất dinh dưỡng khác
nhau, chủ yếu là đạm, lân và kali để tăng trưởng, phát triển tốt và cho năng
suất cao. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây lúa, nông dân phải
sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học, chủ yếu là phân đạm, lân và kali. Ở
Việt Nam, tổng diện tích đất trồng lúa của cả nước trong năm 2014 khoảng 7,8
triệu ha trong đó diện tích trồng lúa tỉnh Phú Yên đạt được 57.021 ha và cần
khoảng 10 triệu tấn phân bón các loại (Cục Trồng trọt, 2014), tuy nhiên hiệu
suất sử dụng phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón
bị mất đi. Trong số lượng phân bón cây trồng không sử dụng được, một phần
bị rửa trôi theo nước mặt rồi chảy vào các ao, hồ, sông suối gây ô nhiễm
nguồn nước mặt và gây ảnh hưởng xấu như gây phì hóa nước và tăng nồng độ
nitrate trong nước, một phần phân bón trực di xuống sâu, gây ô nhiễm nguồn
nước ngầm, một phần bị bay hơi do tác động của nhiệt độ hay quá trình phản
nitrate hóa gây ô nhiễm không khí (Nguyễn Đức Khiển, 2002). Nếu lạm dụng
việc sử dụng phân hóa học như hiện nay thì không những gây ra lãng phí mà
còn tác động và ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái.
Trước sức ép của vấn đề an ninh lương thực, người dân luôn đặt ra mục
đích phải thu nhiều sản phẩm. Song do ý thức và trình độ canh tác chưa cao
nên tình trạng lạm dụng phân bón hóa học đã xảy ra khá phổ biến. Kết quả
điều tra của Sở Nông Nghiệp và PTNT Phú Yên trong năm 2012 cho thấy, chi
phí mà nông dân mua phân bón để sản xuất lúa lên đến 6.000.000 đồng/ha/vụ,
chi phí này > 50% tổng chi phí trong sản xuất lúa. Điều này đã tác động bất lợi
đến chi phí sản xuất, đến môi trường dẫn đến kết quả sản xuất không mang lại
hiệu quả kinh tế cao và chưa có nền sản xuất bền vững. Để khắc phục những
tác động bất lợi này thì việc sử dụng phân bón sinh học trong quá trình sản
xuất nói chung và sản xuất lúa nói riêng thật sự rất có ý nghĩa.
Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã quan tâm nhiều đến những loài vi
khuẩn nội sinh và ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất phân bón. Vi
khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng đối với cây trồng và được ứng dụng trong
sản xuất phân vi sinh, chúng có những đặc tính tốt như có khả năng cố định 2
đạm cho cây trồng, hòa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ tốt chất
dinh dưỡng, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA, tăng hàm lượng các chất
khoáng, tăng khả năng kháng bệnh và giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi
trường (Siciliano et al., 2001) trong đó các vi khuẩn nội sinh tiêu biểu như
Azosprillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Pseudomonas,
Gluconacetobacter, .
Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh có ích trong sản
xuất phân bón vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp nhằm hạn chế phân
bón hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng một nền nông nghiệp
phát triển bền vững. Điều này rất có ý nghĩa, rất cần thiết trong sản xuất nông
nghiệp và trong việc bảo vệ môi trường. Đặc biệt cây lúa cao sản là đối tượng
cần được nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh vì đây là loại cây lương thực chính
được trồng phổ biến ở tỉnh Phú Yên. Hơn nữa, hiện tại ở tỉnh Phú Yên chưa có
một công trình nghiên cứu nào về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Phân lập và khảo sát các
đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú
Yên” đã được thưc hiện.
1.2. Mục tiêu
Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở
tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để
ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy
Hòa thuộc tỉnh Phú Yên.
- Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được bằng phương pháp
truyền thống và phương pháp sinh học phân tử.
- Khảo sát các đặc tính cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA
của các dòng vi khuẩn phân lập được và tuyển chọn những dòng có hoạt tính
cao.
- Định danh các dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao và xây
dựng mối tương quan di truyền bằng phương pháp sinh hóa, sinh lý, hình thái
và di truyền.
- Tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao để ứng
dụng vào sản xuất phân bón vi sinh bằng các thí nghiệm in vitro, trong điều
kiện nhà lưới và ngoài đồng.

3
1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa
* Phạm vi nghiên cứu: các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa được phân
lập từ 119 mẫu lúa thu ở 7 huyện và thành phố bao gồm: Huyện Tuy An, Sơn
Hòa, Đồng Xuân, Phú Hòa, Tây Hòa, Sông Hinh, Đông Hòa và thành phố Tuy
Hòa, tỉnh Phú Yên.
1.5. Những đóng góp mới của luận án
- Phân lập được 593 dòng vi khuẩn trong cây lúa trên 3 loại môi trường
LGI, Nfb và RMR và xác định được 556 dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật
PCR. Dùng phương pháp so màu xác định được 533 dòng vi khuẩn có khả
năng cố định đạm, trong số đó có 457 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân
khó tan và tổng hợp IAA.
- Định danh 90 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm cao và
xây dựng mối quan hệ di truyền.
- Có 22 dòng vi khuẩn được khảo sát vừa có khả năng cung cấp đạm và
đồng thời cung cấp lân cho cây lúa cao sản trong giai đoạn mạ. Trong số đó,
có 8 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và 4 dòng vi khuẩn cung cấp
lân được khảo sát trong điều kiện nhà lưới và 2 dòng vi khuẩn có khả năng
cung cấp đạm, 2 dòng vi khuẩn cung cấp lân hữu hiệu nhất được khảo sát ở
điều kiện ngoài đồng.
- Kết quả nghiên cứu có 8 dòng vi khuẩn được tuyển chọn và ứng dụng
trồng lúa trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng được định danh và mô tả đặc
điểm sinh lý, sinh hóa. Dòng TAL1 tương đồng với chủng Pseudomonas
putida (99%), TALa14 tương đồng với chủng Bacillus megaterium (99%),
TAL4 tương đồng với chủng Bacillus subtilis (99%), TANa5 tương đồng với
chủng Bacillus megaterium (99%), SHL70 tương đồng với chủng
Azospirillum amazonense (98%), PHL87 tương đồng với chủng Burkholderia
kururiensis (99%), PHL103 tương đồng với chủng Burkholderia vietnamiensis
(99%) và PHL105 tương đồng với chủng Bacillus megaterium (99%).
1.6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
* Ý nghĩa khoa học
- Phân lập và nhận diện được các dòng vi khuẩn nội sinh bằng phương
pháp sinh học phân tử. - Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao, hòa
tan lân khó tan, tổng hợp IAA và định danh, xây dựng mối quan hệ di truyền
của các dòng vi khuẩn nội sinh.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể là tài liệu tham khảo và là cơ sở
khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo, cũng như bổ sung giáo trình giảng dạy.
* Ý nghĩa thực tiễn
- Cung cấp nguồn giống vi khuẩn tốt (2 dòng vi khuẩn có khả năng cố
định đạm và 2 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan phân lân khó tan thành lân
dễ tan cung cấp cho cây lúa) để ứng dụng cho việc nghiên cứu và sản xuất
phân vi sinh dùng trong sản xuất lúa tại Phú Yên.
- Kết quả đề tài cũng góp phần làm giảm lượng phân bón hóa học trong
sản xuất lúa và sự ô nhiễm môi trường.