Luận Văn Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại Tp HCM bằng phương pháp PCR và giải

TÓM TẮT


Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt


tại Tp HCM bằng phương pháp PCR và giải trình vùng 16S – 23S rDNA” được thực


hiện từ ngày 6 tháng 2 năm 2005 đến ngày 30 tháng 7 năm 2006 tại trường Đại Học


Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền


Nam.

Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris gây


bệnh đốm lá trên cây cải ngọt. Hiện nay, tại các vùng trồng rau ở Huyện Củ Chi, Hóc


Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh, bệnh đốm lá đang gây thiệt hại rất lớn cho


nông dân trồng rau cải ngọt. Triệu chứng điển hình của bệnh là sự xuất hiện các đốm


nhỏ có kích thước 1 – 2 mm trên lá rau. Khi bệnh phát triển, các đốm bệnh lớn dần, có


thể lên kết lại dẫn đến lá rau bị vàng và chết. Bệnh làm giảm năng suất cũng như chất


lượng cây rau cải ngọt.


Mục đích đề tài nhằm định danh tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, giải trình


tự gen nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh sau này.


Các nội dung nghiên cứu bao gồm:


1. Phân lập tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu được từ các vùng trồng rau ở


huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh.


2. Dùng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen nhằm định danh tác nhân gây bệnh.


Kết quả thu được như sau:


1. Phân lập được 8 dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá tại các vùng trồng rau thuộc


huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, Tp HCM.


2. Sử dụng kỹ thuật PCR đã khuyếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS làm vật liệu


giải trình tự và gen hrpF đặc trưng của vi khuẩn gây bệnh.


3. Do hạn chế phương pháp giải trình tự gen không mang lại kết quả. Tuy nhiên,


kết quả PCR cho phép xác định vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas


campestris pv. campestris.


MỤC LỤC


CHưƠNG TRANG


Trang tựa


Lời cảm tạ .i


Tóm tắt ii


Mục lục iii


Danh sách các chữ viết tắt vi


Danh sách các bảng . vii


Danh sách các hình viii


1. MỞ ĐẦU 1


1.1.Đặt vấn đề 1


1.2.Mục đích và yêu cầu 2


1.2.1. Mục đích 2


1.2.2. Yêu cầu 3


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4


2.1. Tổng quan nghiên cứu ngoài nước 4


2.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố 4


2.1.2. Tác nhân và triệu chứng bệnh .5


2.1.3. Tác động kinh tế của bệnh. .6


2.1.4. Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh .7


2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh 8


2.1.6. Phương pháp phân lập và dịnh danh tác nhân gây bệnh 8


2.1.7. Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây


bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử .10


2.2. Tổng quan nghiên cứu trong nước 12


2.3. Vùng ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF


(hypersensitive reaction and pathogenicity). . 13


2.3.1. Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity). 13


2.3.2. Ribosome DNA (rDNA). 13


3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 15


3.1. Thời gian và địa điểm . 15


3.1.1. Thời gian . 15


3.1.2. Địa điểm 15


3.2. Vật liệu . 15


3.3. Hóa chất 15


3.3.1. Các hóa chất dùng ly trích DNA từ vi khuẩn 15


3.3.2. Các hóa chất dùng trong điện di 16


3.3.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio – Rad cung cấp) 16


3.3.4. Môi trường . 17


3.4. Dụng cụ, thiết bị 17


3.5. Phương pháp 17


3.5.1. Phương pháp thu thập mẫu bệnh . 17


3.5.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh 18


3.5.3. Phương pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lưới 18


3.5.3.1. Phương pháp trồng cây kí chủ 18


3.5.3.2. Chủng bệnh . 19


3.5.4. Phương pháp ly trích DNA từ vi khuẩn 20


3.5.5. Phương pháp PCR .20


3.5.5.1. Khuếch đại đoạn DNA trong vùng ITS của vi khuẩn .20


3.5.5.2. Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF 22


3.5.6. Phương pháp điện di và đọc kết qủa .22


3.5.6.1. Điện di trên gel agarose 22


3.5.6.2. Đọc kết quả điện di .22


3.5.7. Phương pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR. .23


3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA .23


3.5.7.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator V3.1


Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). 24


3.5.7.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại. 25


3.5.7.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer. .25

3.5.7.5. Quy trình tóm tắt các bước đọc trình tự. 26


4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .27


4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh 27


4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lưới 28


4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn. .31


4.4. Kết quả phản ứng PCR. .32


4.4.1. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS. .32


4.4.2. Kết quả điện di tinh sạch sản phẩm PCR .32


4.4.3. Kết quả PCR khuếch đại vùng hrpF. .33


5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .34


TÀI LIỆU THAM KHẢO .36


PHỤ LỤC 39