Thạc Sĩ Phân lập và định danh chủng vi khuẩn Clostridium Sp. sinh tổng hợp Butanol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2011


MỤC LỤC



LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT

Chương 1. MỞ ĐẦU 1
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
2.1. Tổng quan về giống Clostridium . 6
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Clostridium . 10
2.1.2. Cấu trúc và hình thái tế bào 11
2.1.3. Hình thành nội bào tử . 12
2.1.3.1. Đặc tính của bào tử 13
2.1.3.2. Sự nảy mầm bào tử . 15
2.2. Quá trình lên men sinh dung môi ABE ở Clostridium . 15
2.2.1. Lịch sử của quá trình lên men ABE 15
2.2.2. Cơ chất lên men ABE của Clostridium . 18
2.2.3. Con đường biến dưỡng ABE ở C. acetobutylicum . 21
2.2.4. Sự thoái biến khả năng sinh dung môi . 25
2.2.5. Mối liên hệ giữa quá trình sinh dung môi và sự sinh trưởng, phát triển của Clostridium 26
2,2.6. Phương pháp thu nhận dung môi aceton-butanol-ethanol 27
2.2.7. Nhiên liệu sinh học và ứng dụng của butanol 29
2.2.7.1. Nhiên liệu sinh học . 29

2.2.7.2. Ứng dụng của butanol . 30
2.3. Định danh Clostridium bằng kỹ thuật sinh học phân tử . 34
2.4. Giới thiệu cây phát sinh loài . 37

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 40
3.2. Dụng cụ, thiết bị và đối tượng nghiên cứu . 40
3.2.1. Dụng cụ 40
3.2.2. Thiết bị . 40
3.2.3. Môi trường sử dụng nuôi cấy 40
3.2.3.1. Môi trường RCM . 40
3.2.3.2. Môi trường T6 41
3.2.3.3. Triple Sugar Iron Agar (TSI) cho thử nghiệm sinh H2S . 41
3.2.3.4. Môi trường Indole cho thử nghiệm Indol . 41
3.2.3.5. Phenol Red Carbohydrate Broth . 42
3.2.3.6. Thuốc thử kiểm tra sự hiện diện của aceton . 42
3.2.3.7. Hóa chất dùng trong điện di . 42
3.2.3.8. Hóa chất dùng cho PCR . 42
3.2.4. Đối tượng nghiên cứu 43
3.2.5. Chủng vi sinh vật chuẩn 44
3.3. Phương pháp nghiên cứu . 44
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu 44
3.3.2. Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp. có tiềm năng sinh butanol . 47
3.3.2.1. Phân lập chủng Clostridium sp . 47
3.3.2.2. Làm thuần chủng Clostridium sp. . 47

3.3.2.4. Nhuộm Gram 49
3.3.2.5. Nhuộm bào tử 50
3.3.2.6. Kiểm tra khả năng tổng hợp dung môi 50
3.3.3. Kiểm tra khả năng sinh butanol của các chủng Clostridium sp. 51
3.3.3.1. Phương pháp định tính acetone . 51
3.3.3.3. Kiểm tra các đặc tính sinh lý sinh hóa khác . 52
3.3.3.4. Xác định nồng độ butanol tổng hợp bằng sắc ký lỏng cao năng
HPLC .. .. .. . 55
3.3.4. Bảo quản chủng phân lập bằng phương pháp đông khô. . 60
3.3.5. Định danh các chủng Clostridium sp. sử dụng vùng gene 16S rDNA . 60
3.3.5.1. Thu nhận DNA bộ gen cho PCR 16S srDNA 60
3.3.5.2. Khuếch đại PCR trình tự 16S rDNA 61
3.3.5.3. Kiểm tra sự khuếch đại . 66
3.3.5.4. Tinh sạch sản phẩm PCR . 66
3.3.5.5. Giải trình tự và tạo cây phát sinh loài 66

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68

4.1. Phân lập và làm thuần giống Clostridium có tiềm năng sinh butanol 69
4.1.1. Thu nhận mẫu phân tích 69
4.1.2. Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp. sinh butanol . 70
4.1.3 Chọn lọc các chủng Clostridium sp. có khả năng sinh dung môi . 78
4.2. Kiểm tra khả năng sinh butanol của các chủng Clostridium sp. phân lập được . 78
4.2.1. Kiểm tra khả năng đông tụ sữa và định tính acetone 78

4.2.2.1. Khả năng sinh H2S 80
4.2.2.2.Khả năng mẫn cảm với rifampicin . 80
4.2.2.3. Thử nghiệm Indol 80
4.2.2.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau 81
4.2.3. Xác định nồng độ butanol tổng hợp bằng sắc ký lỏng cao năng . 84
4.3. Bảo quản chủng phân lập bằng phương pháp đông khô. 86
4.4. Định danh các chủng Clostridium sp. sử dụng trình tự 16S rDNA . 87
4.4.1. Khuếch đại PCR trình tự 16S rDNA . 87
4.4.2. Kết quả giải trình tự và định danh 88
4.4.3. Thảo luận chung . 95
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98
5.1. Kết luận . 99
5.2. Đề nghị . 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Clostridium thủy phân cellulose và sản phẩm tương ứng 19
Bảng 2.2: Đặc tính của butanol so với xăng và các alcol khác 31
Bảng 3.1: Thời gian lưu các chất 57
Bảng 3.2: Kết quả đo chuẩn glucose 57
Bảng 3.3: Kết quả đo chuẩn butanol 58
Bảng 3.4: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR . 62
Bảng 3.5: Thành phần cho 1 phản ứng PCR với cặp mồi Eubac 27F và 1492R 63
Bảng 3.6: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R . 63
Bảng 3.7: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR . 64
Bảng 3.8: Thành phần của 1 phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và
S-G-Clos-1205-A-21 65
Bảng 3.9: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G- Clos-1205-A- 65
Bảng 3.10: Trình tự 16S rDNA của các loài Clostridium từ NCBI và EMBL 67
Bảng 4.1: Các loại mẫu và địa điểm thu mẫu . 69
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân được trên môi trường RCM của nhóm mẫu I có pH acid (pH ? 6,5). . 71
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm mẫu II có pH trung tính (6,5<pH ? 7,5). . 72
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm mẫu III có pH kiềm (pH > 7,5). 73

Bảng 4.5: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các
chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu I phân lập được trên môi trường RCM 75
Bảng 4.6: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu II phân lập được trên môi trường RCM 76
Bảng 4.7: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu III phân lập được trên môi trường RCM . 76
Bảng 4.8: Kết quả định tính acetone và hình thành cục đông trong môi trường sữa của các chủng vi khuẩn phân lập được 79
Bảng 4.9: Khả năng sinh H2S và mẫn cảm với rifampicin 81
Bảng 4.10: Khả năng sử dụng nguồn carbon của các chủng Clostridium sp. chọn lọc . 81
Bảng 4.11: Tổng kết các đặc điểm của 8 chủng Clostridium sp. tuyển chọn 83
Bảng 4.12: Kết quả phân tích sản phẩm sau lên men của các chủng Clostridium
nghiên cứu 84
Bảng 4.13: Chiều dài vùng gene 16S rDNA giải trình tự 88
Bảng 4.14: Hệ số tương đồng di truyền của 8 chủng nghiên cứu với các chủng
Clostridium đã được công bố trên NCBI 89
Bảng 4.15: Ma trận (%) tương đồng di truyền 16S rDNA của các chủng
Clostridium nằm trong cluster I 92



DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Tế bào sinh dưỡng C. acetobutylicum .6
Hình 2.2: Sự hình thành bào tử ở C. acetobutylicum trong lên men ABE 13
Hình 2.3: Quá trình tạo bào tử gồm 7 bước ở C. saccharobutylicum . 14
Hình 2.4: Chaim Weizmann (1874 – 1952) 16
Hình 2.5: C. beijerinckii sLM01 hoạt động thủy phân cellulose 20
Hình 2.6: Con đường chuyển hóa acid và dung môi của Clostridium . 22
Hình 2.7: Quá trình thay đổi hình thái, sinh dung môi kết hợp hình thành bào tử ở C. acetobutylicum . 27
Hình 2.8: Cấu trúc butanol (C4H9OH) 31
Hình 2.9: Xe 100% Butanol 34
Hình 2.10: Cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ của các loài Clostridium
trong cluster I 38
Hình 3.1: Quy trình phân lập và định danh Clostridium sinh butanol . 45
Hình 3.2: Đường chuẩn HPLC cho glucose 57
Hình 3.3: Đường chuẩn HPLC cho butanol 58
Hình 3.4: Bản đồ vùng gene 16S rDNA của Clostridium. 63
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của một số chủng Clostridium sp. phân lập 74
Hình 4.2: Hình dạng bào tử của một số chủng Clostridium sp. . 77
Hình 4.3: Sự lên men glucose của các chủng Clostridium sp. phân lập . 82
Hình 4.4: Lượng butanol tổng hợp của các chủng Clostridium sp. được chọn sau
7 ngày lên men. . 85
Hình 4.5: Bảo quản các chủng vi khuẩn bằng phương pháp đông khô . 86
Hình 4.6: Sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi 27F-1492R để khuếch đại vùng gen 16S rDNA 87

Hình 4.7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-
1205-A-21 khuếch đại vùng gen 16S rDNA đặc trưng cho giống Clostridium 88
Hình 4.8: Cây phát sinh loài tổng quát thể hiện mối quan hệ của các chủng Clostridium DF3, DL1, DL2, DL3, DL4, DL5, PB7, PB10 với các chủng vi khuẩn khác thuộc giống Clostridium. 91
Hình 4.9: Cây phát sinh loài chi tiết thể hiện mối quan hệ của các chủng
Clostridium DF3, DL1, DL2, DL3, DL4, DL5, PB7, PB10 với các loài
Clostridium khác trong cluster I 94



CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU


Kể từ năm 2000, các quốc gia trên thế giới lần lượt thật sự tuân thủ thoảhiệp Rio de Janeiro (1992) và nghị định thư Kyoto (1997), tìm cách hạn chế thải khí nhà kính (CO2, CH4, N2O, .) khi sử dụng nhiên liệu cổ sinh thay thế bằng năng lượng xanh (như năng lượng mặt trời, gió, thủy điện, .), do đó nhiên liệu sinh học đang được quan tâm phát triển. Nhiên liệu sinh học là loại chất đốt tái tạo, sản xuất từ nguyên liệu động thực vật gọi là sinh khối, gọi là “tái tạo” vì chất đốt cơ bản carbon (C) nằm trong chu trình quang hợp ngắn hạn, đốt nhiên liệu sinh học thải khí CO2, rồi thực vật hấp thụ lại CO2 đó để tạo thành sinh khối, chế biến nhiên liệu sinh học trên lý thuyết coi như không làm gia tăng CO2 trong khí quyển.
Nhiên liệu sinh học có thể ở thể rắn như củi, than củi (than đá thuộc loại cổ sinh, không tái tạo); thể lỏng (như xăng sinh học, diesel sinh học); hay thể khí như khí methane sinh học (sản xuất từ lò ủ chất phế thải), hydrogen sinh học. Nhiên liệu ở thể lỏng được ưa chuộng hơn vì có độ tinh khiết cao, chứa nhiều năng lượng, dễ dàng chuyên chở, dễ tồn trữ và bơm vào bình nhiên liệu của xe. Nhiên liệu sinh học đang là vấn đề quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới vì nhiều lý do: giá xăng cổ sinh ngày càng cao, trữ lượng dầu thô và khí đốt ở các mỏ dầu có giới hạn và sẽ cạn kiệt trong tương lai (dự đoán khoảng năm 2100), nhiều quốc gia muốn ít phụ thuộc vào việc nhập khẩu nhiên liệu cổ sinh trong khi quốc gia họ có khả năng sản xuất nhiên liệu thay thế, và bị áp lực chính trị phải giảm lượng khí CO2 sa thải để phù hợp với nghị định thư Kyoto (1997) quy định. Butanol, acetone, ethanol là những dung môi có khả năng sử dụng làm nhiên liệu. Hiện nay, ethanol đang được sử dụng nhiều, tuy nhiên người ta chú ý đến butanol hơn vì cấu tạo của nó có bốn nguyên tử carbon nên nặng hơn, ít bay hơi, đồng thời có khả năng tạo ra năng lượng cao hơn ethanol và acetone [45]. Với kỹ thuật hiện nay, có 2 phương thức hữu hiệu để chế biến nhiên liệu sinh học:

- Cho lên men (nhờ vi sinh vật và enzyme trong điều kiện yếm khí) chất đường (từ mía, củ cải đường, v.v.), tinh bột [từ hạt ngũ cốc (bắp, lúa, lúa mì, v.v.) và củ (khoai tây, khoai mì, v.v.)], hay cellulose để tạo ra ethanol (C2H5OH), propanol (C3H7OH) và butanol (C4H9OH).
- Trích dầu từ thực vật, tảo giàu chất dầu, hay từ mỡ động vật (ép với áp suất cao và nhiệt, hoặc bằng dung môi, hay phối hợp cả hai).

Trong đó các vi khuẩn lên men từ sinh khối để sinh dung môi có rất nhiều ưu thế như: hạn chế việc tổng hợp nên các hợp chất có khả năng gây ung thư, sử dụng tạo ra các dẫn xuất dung môi cung cấp cho nhu cầu của công nghiệp thực phẩm và hương liệu; các phụ phế phẩm của nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm có thể trở thành nguồn cơ chất đầy tiềm năng, rẻ tiền cho quá trình lên men để sản xuất các dung môi cho giá trị thương mại cao. Tuy nhiên, việc tầm soát để phân lập và chọn các chủng vi sinh vật cần thiết là đòi hỏi đầu tiên trong các quy trình lên men sinh học hiện đại, đặc biệt là quá trình chuyển hóa trực tiếp các polysaccharide từ sinh khối thành các sản phẩm có giá trị cao với sự hiện diện rộng rãi của các enzyme thủy phân ngoại bào rất được quan tâm.
Giống Clostridium là tập hợp các loại vi khuẩn Gram dương, kị khí nghiêm ngặt, tạo bào tử, hình que [9]. Clostridium gồm nhiều chủng dễ dàng được phân lập từ các mẫu đất ở những vùng miền khác nhau, có khả năng lên men tạo butanol cao, đặc biệt là một số loài có khả năng sử dụng cellulose làm nguồn cơ chất lên men, các chủng Clostridium acetobutylicum, C. beijerinckii, C. butyricum, C. saccharobutyricum, C. saccharoperbutyricum là những vi sinh vật tiềm năng nhất [7].

Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới có độ đa dạng sinh học cao thuận lợi cho việc phân lập các chủng Clostridium sp. Do vậy, việc phân lập, xác định vi khuẩn Clostridium có tiềm năng sinh dung môi từ các nguồn tài nguyên thiên nhiên của Việt Nam có ý nghĩa to lớn, góp phần khai thác tính đa dạng sinh học và đồng thời thúc đẩy nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học, vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SP. SINH TỔNG HỢP BUTANOL”.
Đề tài được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề:

1. Phân lập, sàng lọc và xác định các chủng vi khuẩn Clostridium sp. kỵ khí nghiêm ngặt, có khả năng sinh butanol từ các nguồn mẫu khác nhau như đất canh tác nông nghiệp, phân của động vật, bùn ao hồ.
2. Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng Clostridium sp. phân lập được là Gram dương, hình thành nội bào tử, sinh tổng hợp butanol.
3. Xác định khả sinh tổng hợp butanol của các chủng Clostridium sp. phân lập được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao năng HPLC.
4. Định danh các chủng Clostridium sp. phân lập được bằng kỹ thuật sinh học phân tử: tách chiết DNA bằng DNAzol Direct PCR, khuếch đại đoạn gene 16S rDNA có kích thước 1,5 kb sử dụng cặp mồi Eubac27F và 1492R. Các sản phẩm khuếch đại được tinh sạch và giải trình tự, xây dựng cây phát sinh loài để xác định mối quan hệ giữa các loài phân lập được.