Thạc Sĩ Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi

MỞ ĐẦU

Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã
hội, nhu cầu về nguyên liệu và nhiên liệu của con người ngày càng tăng, đã
kéo theo sự mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như: công
nghiệp dầu mỏ, khai thác chế biến than, công nghiệp sản xuất sơn, sản xuất
các hóa chất tẩy rửa .
Quảng Ninh là một tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm Bắc Bộ, có
tốc độ tăng trưởng kinh tế cao so với bình quân chung của cả nước. Trong
những năm gần đây, các ngành công nghiệp và dịch vụ chiếm một tỷ trọng
lớn, khoảng trên 80% GDP của tỉnh. Các ngành công nghiệp khai thác và chế
biến than, xi măng, đóng tàu, nhiệt điện, sản xuất vật liệu xây dựng đang có
tốc độ phát triển nhanh. Quảng Ninh là một trong những điểm trung chuyển
xăng dầu lớn nhất cả nước. Hoạt động vận tải đường bộ, đường thủy; các hoạt
động du lịch, vận tải khách du lịch .diễn ra hết sức sôi động. Các hoạt động
trên đã tạo ra một bộ mặt kinh tế rất đa dạng của Quảng Ninh. Tuy nhiên, các
hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc
biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế biến và sử dụng vật
liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu ở Quảng Ninh.
PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm.
Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và
các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của
dầu mỏ [16]. Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và
là chất gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ
(USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành
kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên
cạn [16], [50].
Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh,
ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH4NO3) thì sự có mặt của dầu và một
số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra
đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện
nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử
dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi
chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp.
Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học
đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành
thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi
trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập
trung nghiên cứu về điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả
năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật.
Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong
quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân
hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm. Catechol là một trong các sản phẩm
trung gian của quá trình phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm, do vậy
các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu
quan tâm.
Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên
cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng
phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được
phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”.
Mục tiêu nghiên cứu:
Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng
phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm.
Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:
1. Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân hủy
PAH.
2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số
chủng vi khuẩn đã được phân lập.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn
có khả năng phân hủy PAH.
4. Phân loại định tên đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH dựa
trên việc xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA.

MỤC LỤC

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1
DANH MỤC CÁC BẢNG .2
DANH MỤC CÁC HÌNH 3
MỞ ĐẦU
CHưƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .8
1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .8
1.1.1. Tính chất hóa lý 8
1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hưởng của nó tới môi trường
sống .10
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH 13
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam .13
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh 14
1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 15
1.3.1 Phương pháp hóa lý 16
1.3.2. Phương pháp phân hủy sinh học .16
1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 19
1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH .19
1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV .21
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phân hủy các hợp chất
hydrocarbon thơm đa nhân .25
1.6. Các phương pháp phân loại vi sinh vật 29
1.6.1. Phương pháp phân loại truyền thống .29
1.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử .30
CHưƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Nguyên liệu và hóa chất 33
2.1.1. Nguyên liệu .33
2.1.2. Hóa chất .33
2.2. Môi trường nuôi cấy 33
2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu .34
2.4. Phương pháp nghiên cứu .34
2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nước nhiễm dầu 34
2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số
chủng vi khuẩn .35
2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn 36
2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol
2,3-dioxygenase 36
2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo
phương pháp của Sambrook, Russell 36
2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR 37
2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng 38
2.4.4.4. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự
động 40
2.4.4.5. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại .41
CHưƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển
trên môi trường chứa PAH .42
3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 .44
3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn
BQN31 .45
3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng
BQN31 .49
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa
16S rRNA bằng kỹ thuật PCR .49
3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 50
3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc
thích hợp 52
3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 .54
3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng
BQN31 .57
IV. KẾT LUẬN 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO .63


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

bp Base pair (cặp bazơ)
USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ
môi trường Hoa Kỳ)
LB Luria-Bertani
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
POP Persistent Organic Pollutant
DNA Deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
VSV Vi sinh vật
X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
àl Microlit
àm Micromet
PAH

Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa
nhân)
ppm đơn vị một phần triệu (mg/l)

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH . 9
Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH . 20
Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật . 30
Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng
có bổ sung các hợp chất PAH 42
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn . 44
Bảng 3.3: phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng
BQN31 . 46
Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 46
Bảng 3.5: Độ tương đồng của chủng BQN31 so với một số đại diện
đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế 56
Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3
dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công
bố trên ngân hàng gen quốc tế . 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân
(PAH) 8
Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật . 21
Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn
và nấm 22
Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30,
BQN31, BQN32, BQN33 43
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31 . 45
Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 45
Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 . 50
Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của
chủng BQN31 . 50
Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 51
Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng
được lựa chọn . 52
Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 . 53
Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng
vi khuẩn BQN31 . 53
Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 . 54
Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen
mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại
diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000
nucleotide so sánh . 55