Thạc Sĩ Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của m ột vài chủng vi

MỞ ĐẦU

Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về nguyên liệu và nhiên liệu của con người ngày càng tăng, đã kéo theo sự mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như : công nghiệp dầu mỏ, khai thác chế biến than, công nghiệp sản xuất sơn, sản xuất các hóa chất tẩy rửa .
Quảng Ninh là một tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm Bắc Bộ, có tốc độ tăng trưởng kinh tế cao so với bình quân chung của cả nước. Trong những năm gần đây, các ngành công nghiệp và dịch vụ chiếm một tỷ trọng lớn, khoảng trên 80% GDP của tỉnh. Các ngành công nghiệp khai thác và chế biến than, xi măng, đóng tàu, nhiệt đ iện, sản xuất vật liệu xây dựng đang có tốc độ phát triển nhanh. Quảng Ninh là một trong những đ iểm trung chuyển xăng dầu lớn nhất cả nước. Hoạt động vận tải đường bộ, đường thủy; các hoạt động du lịch, vận tải khách du lịch .diễn ra hết sức sôi động. Các hoạt động trên đã tạo ra một bộ mặt kinh tế rất đa dạng của Quảng Ninh. Tuy nhiên, các hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế b iến và sử dụng vật liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu ở Quảng Ninh.
PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm. Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của dầu mỏ [16]. Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và là chất gây ô nhiễm mô i trường nghiêm trọng. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16], [50].

Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh, ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH4 NO3) thì sự có mặt của dầu và một số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện
nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp.
Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học

đã và đang khẳng đ ịnh tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu về đ iều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật. Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm. Catechol là một trong các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy s inh học các hợp chất vòng thơm, do vậy các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm.
Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của m ột vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”.

Mục tiêu nghiên cứu:


Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm.

Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm :

1. Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân h ủy

PAH.

2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH.
4. Phân loại định tên đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH dựa trên việc xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA.




Lê Tiến Mạnh

MỤC LỤC



BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC CÁC BẢNG .2

DANH MỤC CÁC HÌNH 3

MỞ ĐẦU

CHưƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .8

1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .8

1.1.1. Tính chất hóa lý 8

1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hưởng của nó tới mô i trường

sống .10

1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH 13

1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam .13

1.2.2. Nguồn gốc phát sinh 14

1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 15

1.3.1 Phương pháp hóa lý 16

1.3.2. Phương pháp phân hủy sinh học .16

1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 19

1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH .19

1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV .21

1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .25
1.6. Các phương pháp phân loại vi sinh vật 29

1.6.1. Phương pháp phân loại truyền thống .29

1.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử .30

CHưƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1. Nguyên liệu và hóa chất 33

2.1.1. Nguyên liệu .33

2.1.2. Hóa chất .33

2.2. Môi trường nuôi cấy 33

2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu .34

2.4. Phương pháp nghiên cứu .34

2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nước nhiễm dầu 34

2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số

chủng vi khuẩn .35

2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn 36

2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol

2,3-dioxygenase 36

2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo

phương pháp của Sambrook, Russell 36

2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR 37

2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng 38

2.4.4.4. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động 40
2.4.4.5. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại .41

CHưƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển

trên mô i trường chứa PAH .42

3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 .44

3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn

BQN31 .45

3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng

BQN31 .49

3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa

16S rRNA bằng kỹ thuật PCR .49

3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 50

3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc

thích hợp 52

3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 .54

3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng

BQN31 .57

IV. KẾT LUẬN 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO .63