Thạc Sĩ Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azoterbacter –

MỞ ĐẦU
 Đặt vấn đề
Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí N2 với liên kết cộng hóa trị rất bền vững (N≡N), thực vật không thể sử dụng trực tiếp được. Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này thì cần phải phá vỡ liên kết bền vững trong phân tử N2, tạo ra các loại đạm mà cây trồng có thể hấp thu được. Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta thực hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia của nhiều chất xúc tác, do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người.
Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thì việc nghiên cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ trong khí quyển vào trong đất mà không tác động đến môi trường và sức khỏe con người đã được nghiên cứu. Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase. Azotobacter là giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng làm giàu nguồn đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được. Chúng có khả năng này là nhờ quá trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N2 trong không khí thành NH3 dưới tác dụng của enzyme nitrogenase. Ngoài ra chúng còn kích thích hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật (NO3 -, PO4 3-, K+, Fe2+), sản sinh ra các chất có khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật (indole 3-acetic acid, indole- lactic acid ). Loài vi sinh vật trên phân bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng hiện diện quá ít không đem lại hiệu quả cao. Do đó, việc phân lập, tuyển chọn chủng giống có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những khâu quan trọng nhằm nâng cao năng suất cây trồng.
Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azoterbacter – Thử nghiệm trên cây trồng”.

 Mục tiêu của nghiên cứu:
Tuyển chọn được chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm cao từ các chủng phân lập, nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng và cố định đạm của các chủng chọn lọc, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực trồng trọt.
 Nội dung thực hiện:
- Phân lập chủng Azotobacter từ các mẫu đất ở Hà Nội, Lâm Đồng, Đông Nai, Long An, Tiền Giang, Bến Tre.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập.
- Tuyển chọn chủng có hoạt tính cố định đạm cao.
- Định danh đến loài các chủng chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA.
- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng và cố định nitơ của chủng chọn lọc.
- Thử nghiệm hiệu quả của các chủng chọn lọc trên cây cải xanh (Brassica Juncea).
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT . ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU iii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ v
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ vii
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đai cương về nitơ . 3
1.1.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên 3
1.1.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật . 5
1.1.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên . 5
1.1.3.1. Quá trình khoáng hóa . 5
1.1.3.2. Quá trình phản nitrat hóa 6
1.1.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử . 6
1.2. Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ 7
1.2.1. Phân loại 7
1.2.2. Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ 8
1.3. Vi khuẩn Azotobacter . 9
1.3.1. Đặc điểm phân loại 9
1.3.2. Tổng quan về Azotobacter . 10
1.3.3. Đặc điểm hình thái . 13
1.3.4. Đặc tính di động 15
1.3.5. Sự hình thành bào xác (cyst) 16
1.3.6. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 16
1.3.6.1. Khả năng sử dụng nguồn carbon 16
1.3.6.2. Khả năng sử dụng nguồn Nitrogen . 17
1.3.6.3. pH 18
1.3.6.4. Nhiệt độ . 18
1.3.6.5. Nhu cầu về oxy 19
1.3.6.6. Dinh dưỡng khoáng . 19
1.4. Sự cố định đạm của vi sinh vật . 20
1.4.1. Cấu trúc và sự hoạt động của nitrogenase . 20
1.4.2. Cơ chế của nitrogenase . 24
1.4.3. Sự điều hòa cố định đạm 26
1.5. Khả năng của Azotobacter sử dụng trong nông nghiệp . 27
1.6. Các nghiên cứu, ứng dụng trong và ngoài nước 28
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu . 31
2.1.1. Mẫu phân lập . 31
2.1.2. Các môi trường dùng trong thí nghiệm . 31
2.2. Các phương pháp thực hiện 33
2.2.1. Phương pháp xác định đạm tổng số theo Kjeldahl 33
2.2.2. Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ trong
dịch nuôi cấy Azotobacter . 33
2.2.3. Phương pháp phân lập và làm thuần . 33
2.2.4. Xác định mật độ tế bào dựa vào đường tương quan
tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật độ tế bào log (N/ml) . 34
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng phân lập . 35
2.2.5.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học . 35
2.2.5.2. Xác định Gram của vi khuẩn 35
2.2.5.3. Thử nghiệm catalase 36
2.2.5.4. Khả năng di động . 37
2.2.5.5. Nhuộm vỏ nhầy Anthony (Tyler cải tiến) 38
2.2.5.6. Khả năng sử dụng nguồn carbon 38
2.2.6. Chọn lọc chủng có khả năng cố định đạm cao từ các chủng phân lập được 38
2.2.7. Định danh các chủng chọn lọc 39
2.2.8. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên
sự tăng trưởng và cố định đạm của chủng chọn lọc . 39
2.2.8.1. Chọn môi trường thích hợp cho chủng chọn lọc . 39
2.2.8.2. Ảnh hưởng của pH . 39
2.2.8.3. Ảnh hưởng của các nguồn carbon 39
2.2.8.4. Ảnh hưởng của một số ion khoáng 40
2.2.8.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 40
2.2.8.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ . 40
2.2.8.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 40
2.2.9. Thử nghiệm khả năng cố định nitơ của chủng chọn lọc trong đất . 41
2.2.10. Thử nghiệm ảnh hưởng của hỗn hợp hai chủng lên
sự phát triển của cây cải xanh . 41
PHÂN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả phân lập . 44
3.2. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng phân lập 50
3.3. Chọn lọc chủng có khả năng cố định đạm cao 52
3.4. Định danh hai chủng Az 03 và Az 07 . 54
3.4.1. Kết quả dịnh danh chủng Az 03 . 55
3.4.2. Kết quả định danh chủng Az 07 . 57
3.5. Một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng và
cố định đạm của chủng Az 03 và Az 07 59
3.5.1. Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 59
3.5.2. Ảnh hưởng của pH . 62
3.5.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon 65
3.5.4. Ảnh hưởng của ion khoáng 70
3.5.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc . 74
3.3.6. Ảnh hưởng của nguồn đạm 76
3.5.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 80
3.6. Thử nghiệm khả năng cố định nitơ của hai chủng Az 03 và Az 07 trong đất . 83
3.7. Thử nghiệm ảnh hưởng của hỗn hợp hai chủng lên
sự phát triển của cây cải xanh 84
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận 87
4.2. Đề nghị . 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC