Thạc Sĩ Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azosporillum trong rễ cây ngô tại một số địa

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU . 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu của đề tài . 2
3. Ý nghĩa của đề tài . 2
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1 Giới thiệu về cây ngô 3
1.1.1 Phân loại thực vật 3
1.1.2 Đặc điểm hình thái cây ngô . 3
1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô . 4
1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt độ . 4
1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng . 4
1.1.3.3 Yêu cầu về nước . 5
1.1.3.4 Yêu cầu về đất 5
1.1.3.5 Yêu cầu chế độ không khí trong đất 5
1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô . 6
1.1.4.1 Vai trò của đạm 6
1.1.4.2 Vai trò của lân 6
1.1.4.3 Vai trò của kali . 6
1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng 7
1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N) . 7
1.2.1 Vi khuẩn cố định N tự do . 7
1.2.1.1 Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí 7
1.2.1.2 Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium . 9
1.2.2 Vi khuẩn cố định N cộng sinh 9
1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu 9
1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu 10iv
1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc 13
1.4 Nghiên cứu trong nước . 15
PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1 Nội dung nghiên cứu 17
2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu . 17
2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu . 17
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 18
2.2.3 Thời gian nghiên cứu . 18
2.3 Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1 Phương pháp thu mẫu 18
2.3.2 Phương pháp phân lập . 18
2.3.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng
Azospirillum . 20
2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum . 20
2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm
bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô 21
2.3.6 Phương pháp định danh các chủng Azospirillum được tuyển chọn bằng kỹ
thuật PCR . 23
2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng
Azospirillum được tuyển chọn 23
2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh
khối của các chủng Azospirillum 23
2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối
của các chủng Azospirillum 25
2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các
chủng Azospirillum . 25
2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến
sinh khối của các chủng Azospirillum . 25v
2.3.7.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối
của các chủng Azospirillum 25
2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn
Azospirillum được tuyển chọn trên đồng ruộng . 26
2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu thống kê . 28
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa
điểm của tỉnh Đăk Nông . 29
3.2 Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng Azospirillum 30
3.3 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum
. 34
3.4 Kết quả tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm bằng
nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô . 37
3.4.1 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến sinh trưởng của cây ngô trong
bầu đất 37
3.4.2 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến hàm lượng đạm trong lá ngô 41
3.4.3 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến hàm lượng diệp lục trong lá 43
3.5 Kết quả định danh các chủng Azospirillum được tuyển chọn bằng kỹ thuật
PCR 45
3.6 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum
được tuyển chọn . 46
3.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các
chủng Azospirillum . 46
3.6.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của
các chủng Azospirillum . 47
3.6.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng
Azospirillum . 49
3.6.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối
của các chủng Azospirillum 51vi
3.6.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến sinh
khối của các chủng Azospirillum 53
3.7 Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn Azospirillum
được tuyển chọn trên đồng ruộng . 55
3.7.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển
chọn đến sinh trưởng của cây ngô . 55
3.7.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển
chọn đến chiều cao cây ngô 55
3.7.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển
chọn đến số lá của cây ngô . 58
3.7.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển
chọn đến chiều dài lá cây ngô . 61
3.7.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn
đến đường kính gốc 63
3.7.1.5 Kết quả xác định hàm lượng diệp lục trong lá . 65
3.7.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển
chọn đến năng suất của cây ngô 66
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72
4.1 Kết luận 72
4.2 Kiến nghị 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC vii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABA Abscisic acid
BNF Biological nitrogen fixation
bp Base pairs
Cs Cộng sự
Cl Clo
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate
ĐC Đối chứng
EtBr Ethidium bromide
GA Gibberillins
IAA Indole - 3 - acetic acid
IBA Indole - 3 - butyric acid
K 2 O Kali nguyên chất
Mg Magie
N Đạm
NT Nghiệm thức
PCR Polymerase chain reaction
PHB Poly hydroxybutyrate
P 2 O 5 Lân nguyên chất
S Lưu huỳnh
VK Vi khuẩn viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azospirillum 30
Bảng 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng Azospirillum 33
Bảng 3.3. Giá trị OD 530nm đo được ở các nồng độ IAA pha loãng khác nhau 34
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của các chủng
Azospirillum (mg/l) . 35
Bảng 3.5. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trồng trong bầu đất 37
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến sinh khối tươi và khô của
cây ngô . 39
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến hàm lượng N tổng số
trong lá ngô. . 41
Bảng 3.8. Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) . 43
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng
Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) . 46
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng
Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) . 48
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng Azospirillum (
x 10 9 tế bào/ml) 50
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng
Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) . 52
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng
Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) . 54
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nghiệm thức đến chiều cao cây (cm) 56
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nghiệm thức đến số lá của cây ngô (lá/cây) 59
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nghiệm thức đến chiều dài lá của cây ngô (cm) . 61
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nghiệm thức đến đường kính gốc cây ngô (mm) 64
Bảng 3.18. Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) . 65ix
Bảng 3.19. Các chỉ tiêu năng suất của cây ngô trồng ngoài đồng 67
Bảng 3.20. Khối lượng khô 100 hạt và năng suất lý thuyết . 70x
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 3.1. Phương trình đường chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa chỉ
số OD 530nm và nồng độ IAA (mg/l) . 35
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng
Azospirillum . 47
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng
Azospirillum . 49
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng Azospirillum
. 51
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các
chủng Azospirillum . 53
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng
Azospirillum . 55
Biểu đồ 3.7. Hàm lượng diệp lục trong lá (mg/g) 66
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến số
hạt/hàng của bắp ngô. 68
Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến chiều
dài của bắp ngô. . 69
Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến năng
suất lý thuyết. . 71xi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1. Phân lập vi khuẩn từ môi trường bán đặc Nfb . 29
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA của các chủng Azospirillum được tuyển chọn 451
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nâng
cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất
thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát
triển nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta
vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô
sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó, nghiên cứu
để hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết.
Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và
quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [5].
Hướng đến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái bền vững, trong vài
chục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích khu trú
trong rễ cây trồng không thuộc cây họ đậu, đặc biệt ở cây ngũ cốc. Theo
Doebereiner, vi khuẩn Azospirillum ở trong rễ cây không gặp phải sự cạnh tranh
nguồn Carbon như vi khuẩn khu trú trên bề mặt rễ và có thể cung cấp đạm cho
cây trồng mà không phải nhờ đến khi tế bào chết [35].
Nhóm Azospirillum là vi khuẩn sống trong rễ các loại cây ngũ cốc như
lúa, ngô. Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kích
thích sinh trưởng thực vật IAA, GA 3 góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất,
kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và
phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [35]
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn thuộc
chi Azospirillum trong rễ lúa. Bên cạnh đó, ngô là một đối tượng có vòng đời
sinh trưởng và phát triển tương đối ngắn, ít đầu tư, hiệu quả kinh tế cao, được
trồng phổ biến. Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm
Azospirillum trong rễ cây ngô còn rất ít. Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên 2
cứu nào về thành phần loài của chi Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa
phương của tỉnh Đăk Nông.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập,
tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô
tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng Azospirillum cố định đạm
trong rễ cây ngô.
- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủng Azospirillum có hoạt
tính cố định đạm làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô.
3. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
Xác định được một số chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm, sống
nội sinh trong rễ cây ngô.
Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azospirillum sống
nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm để sản xuất phân vi sinh có
hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng
suất cây ngô và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.