Luận Văn Phân lập, tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, gây độc tế bào và hoạt tính

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . .1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . .3
1.1. Tìm hiểu về nấm nội sinh thực vật . 3
1.1.1. Nấm nội sinh thực vật là gì? . 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu nấm nội sinh thực vật . 3
1.1.2.1. Tình nghiên cứu trên thế giới . .3
1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam . .4
1.1.3. Quan hệ giữa NNS và cây chủ . 6
1.1.4. Các sản phẩm tự nhiên từ NNS . .8
1.1.4.1. Chất kháng sinh . . 8
1.1.4.2. Chất chống ung thư . .11
1.1.4.3. Chất chống oxy hóa . .14
1.2. Họ thông (Pinaceae) . 15
1.2.1. Đặc điểm chung . .15
1.2.2. Phân bố . .16
1.2.3. Phân loại . 17
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . .19
2.1. Vật liệu . .19
2.1.1. Mẫu cây . .19
2.1.2. Chủng VSV kiểm định . 19
2.1.3. Các dòng tế bào . .19
2.1.4. Dụng cụ và hóa chất . 19
2.1.5. Môi trường . 20
2.1.5.1. Môi trường phân lập . 20
2.1.5.2. Môi trường nuôi cấy và giữ chủng NNS . 20
2.1.5.3. Môi trường thử hoạt tính enzym . 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu . .21
2.2.1. Phân lập các chủng NNS . 21




2.2.2. Sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ của các chủng NNS phân lập được 22
2.2.3. Xác định trọng lượng sinh khối khô . .22
2.2.4. Hoạt tính enzym ngoại bào . .22
2.2.4.1. Xác định xenlulaza . .22
2.2.4.2. Xác định amilaza . .23
2.2.4.3. Xác định proteaza . .24
2.2.5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của chủng
nấm .24
2.2.5.1. Lựa chọn môi trường thích hợp . .24
2.2.5.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu . .24
2.2.5.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy . 24
2.2.5.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ . .24
2.2.6. Lên men, chiết rút các thành phần có hoạt tính sinh học của 2 chủng
NNS .25
2.2.7. Xác định hoạt tính sinh học của các cặn chiết . .25
2.2.7.1. Hoạt tính kháng VSVKĐ . .25
2.2.7.2. Hoạt tính gây độc tế bào . 26
2.2.7.3. Hoạt tính chống oxy hóa . 27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng NNS . .28
3.2. Sàng lọc sơ bộ các chủng có hoạt tính sinh học . .29
3.3. Các điều kiện nuôi thích hợp cho hoạt tính kháng VSVKĐ và sinh
khối khô của 2 chủng nấm HT18Đ và NV8T . .31
3.3.1. Môi trường thích hợp . .31
3.3.2. Điều kiện pH thích hợp . .34
3.3.3. Lựa chọn thời gian lên men thích hợp để thu nhận sản phẩm . .36
3.3.4. Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp . 39
3.3.5. Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp . .41




3.4. Tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của các cặn chiết EtOAc thu
được từ dịch nuôi cấy của các chủng HT18Đ và NV8T . .43
3.4.1. Hoạt tính kháng VSVKĐ . .43
3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào . 44
3.4.3. Hoạt tính chống oxy hóa . 44
3.4.4. Hoạt tính enzym ngoại bào . .45
KẾT LUẬN . .46
PHỤ LỤC . .47
TÀI LIỆU THAM KHẢO . .49




MỞ ĐẦU
Nấm nội sinh là nhóm vi sinh vật sống trong mô thực vật và được tìm
thấy ở hầu hết các loài thực vật trên Trái đất, mỗi một loài thực vật đều là vật
chủ của một hay nhiều loại nấm nội kí sinh. Tuy nhiên nấm nội sinh chỉ bắt
đầu được nghiên cứu trong khoảng hai thập kỷ trở lại đây khi người ta nhận
thấy mối liên hệ chặt chẽ giữa chúng và thực vật chủ. Hàng loạt nghiên cứu
đã được tiến hành sâu hơn để có thể đưa ra kết quả chứng minh về tầm quan
trọng của nấm đối với qui luật trao đổi chất bên trong cây, bảo vệ cây kháng
lại một số sâu hại, dịch bệnh, thậm chí là các điều kiện khắc nghiệt của môi
trường Trong khoảng 500.000 loài thực vật bậc cao tồn tại trên Trái đất, chỉ
một số ít loài đã được nghiên cứu về sinh vật nội sinh. Điều đó có nghĩa, cơ
hội để chúng ta nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất mới từ nấm nội sinh vẫn
rất rộng mở.
Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên nước ta có một thảm thực vật
rừng vô cùng phong phú. Tuy nhiên trong những năm gần đây do áp lực tăng
dân số và phát triển kinh tế nhanh, thảm thực vật rừng nước ta bị suy giảm và
phân cắt mạnh làm cho cấu trúc hữu hiệu được thiết lập trong quá trình hình
thành loài và quần thể bị phá vỡ. Để bảo tồn nguồn gen của các loài thực vật
quý hiếm, đang có nguy cơ tuyệt chủng cao, xác định tính đa dạng di truyền ở
mức độ loài và quần thể, cùng với nghiên cứu mức độ tiến hoá, mối quan hệ
di truyền giữa các loài trong tự nhiên, đặc biệt các loài nấm nội sinh trong
thực vật có vai trò quan trọng góp phần đưa ra các chiến lược bảo tồn và phục
hồi loài hữu hiệu. Điều này được ghi nhận như là chìa khoá cho sự thành công
trong lĩnh vực quản lý, bảo tồn và phục hồi các loài quý hiếm (Rao, 2004).
Các loài Thông là những cây rừng quan trọng và đóng vai trò rất lớn về
kinh tế, sinh thái và văn hoá ở nước ta. Tuy vậy 2/3 trong số các loài Thông ở
nước ta đang bị đe dọa nghiêm trọng, bị khai thác quá mức do chúng đều có
giá trị thương mại cao. Nếu các loài Thông bị đe dọa sẽ kéo theo sự biến mất
của các loài nấm nội sinh trong cây Thông, nguồn tài nguyên cũng không kém
phần giá trị trong nghiên cứu khai thác các chất chống ung thư như taxol,
paclitaxel . được tìm thấy trong các loài nấm này. Có thể coi các loài Thông
quí hiếm chính là “ngôi nhà” của các vi sinh vật nội sinh quí giá cần nghiên
cứu. Bảo tồn các loài Thông quí hiếm đồng thời nghiên cứu phân lập, sàng lọc
hoạt tính sinh học các nấm nội sinh trong cây là một việc làm có ý nghĩa khoa
học và thực tiễn nhằm tiết kiệm thời gian, công sức và có sự kết hợp đa ngành
trong nghiên cứu bảo tồn và phục hồi các tài nguyên thiên nhiên quí
hiếm.Với mục đích trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, lựa chọn các
chủng nấm có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, gây độc tế bào và hoạt
tính chống oxy hóa nội sinh trên cây họ thông Pinaceae”.