Luận Văn Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hương mắm đặc trưng và ứng dụng vào

Đề tài “Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hương mắm đặc trưng và ứng dụng vào sản xuất nước mắm chay từ nấm” được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2007 đến 7/2007 nhằm tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân và gây hương tốt để ứng dụng thử vào sản xuất thử nghiệm nước mắm chay ngắn ngày từ nấm.
Đề tài tiến hành gồm 5 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện ưu thế trong chượp mắm trên môi trường NA, NB, cơ bản và nước chiết nấm rơm. Thí nghiệm 2: khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập được ở thí nghiệm 1 trên môi trường nước chiết nấm rơm được bổ sung muối với nồng độ tăng dần từ 0% đến 20%.dựa hàm lượng đạm formol sinh ra sau mỗi lần bổ sung muối được đo bằng phương pháp chuẩn độ formol.
Thí nghiệm 3: khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được từ thí nghiệm 1 và bố trí trên môi trường nước chiết nấm rơm có 20% muối. Thời gian theo dõi sau 24 giờ, khảo sát khả năng hàm lượng đạm formol được sinh ra
bằng phương pháp chuẩn độ formol.
Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng sinh hương của các chủng vi sinh vật phân lập được từ thí nghiệm 1 trên môi trường nước chiết nấm rơm có 20% muối. Thời gian theo dõi sau 3 ngày, ghi nhận kết quả qua phép thử cho điểm bằng phương pháp
đánh giá cảm quan.
Thí nghiệm 5:Sản xuất nước mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lập được. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là 400oC-500oC. Tỉ lệ phối trộn của dứa từ 15% đến 45%. Sản phẩm nước mắm chay có bổ sung vi khuẩn gây hương Clostridium.sp và vi khuẩn thủy phân Bacillus.sp được phân lập và tuyển chọn từ các thí nghiệm 1, thí nghiệm 2, thí nghiệm 3, thí nghiệm 4 để cho ra sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất.
Kết quả thu được:
Tất cả các chủng đều có khả năng chịu mặn. Chủng Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 được chọn làm tác nhân thủy phân.
Chủng Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 được chọn làm tác nhân sinh hương. Nghiệm thức 5 với công thức phối trộn giữa các thành phần nguyên liệu là 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngư + 15% muối + 10% canh khuẩn vi khuẩn hiếu khí (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1) + 10% vi khuẩn kị khí (gồm vi khuẩn Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 theo tỉ lệ 1:1) được chọn làm công thức phối trộn để sản xuất sản phẩm hoàn chỉnh.
1.1.Đặt vấn đề.
Trung Quốc có nước tương, Việt Nam có nước mắm. Từ lâu nước mắm đã trở thành một loại nước chấm rất thông dụng và gần gũi với người dân Việt Nam, những ai đi xa khi nhớ đến quê hương thì không thể quên hương vị của nước mắm quê nhà. Người nước ngoài thì biết đến nước mắm như món ăn truyền thống của người Việt Nam, đã có bài báo so sánh nước mắm đối với Việt Nam giống như rượu cônhắc đối với nước Pháp.Vừa được xem là loại gia vị vừa được xem là thực phẩm giàu dinh dưỡng, nó chứa nhiều acid amin không thay thế như lysin, valin các vitamine hoà tan trong nước B1, B2, PP và các nguyên tố Ca, P, S
Khi xã hội phát triển,chất lượng cuộc sống ngày càng được nâng cao thì con người luôn đòi hỏi đến các loại thực phẩm không chỉ về chất lượng và mùi vị, mà còn phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhưng vẫn giữ được giá cả hợp lý. Và
những yêu cầu này không loại trừ nước mắm.
Ngoài ra vấn đề cạnh tranh giữa các hãng nước mắm không chỉ trong nước mà còn ngoài nước như Thái Lan thì các yêu cầu trên càng được quan tâm hơn. Trong khi đó, công nghệ sản xuất nước mắm ở Viêt Nam còn mang tính thủ công, hiệu
suất lên men thấp, thời gian lên men kéo dài và đây cũng là nhược điểm lớn nhất. Vì vậy nếu chúng ta có được chủng vi sinh vật thủy phân đạm và gây hương thì ta có thể linh động hơn trong quá trình sản xuất đồng thời có thể sử dụng các nguồn
nguyên liệu giàu đạm khác nhau và rút ngắn được chu kì sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm, nâng cao hiệu suất kinh tế.
Bên cạnh đó việc tìm các nguồn nguyên liệu mới nhằm làm đa dạng sản phẩm nước mắm cũng là một nhu cầu cấp thiết trên thị trường. Làm sao để có một sản phẩm nước mắm mà những người an chay vẫn có thể dùng? Ta biết rằng từ lâu nấm
đã được coi là một đặc sản thơm ngon có giá trị dinh dưỡng cao. Hàm lượng đạm trong nấm cao hơn bất kì loại rau quả nào khác, hàm lượng muối khoáng trong nấm cao hơn thịt cá và đặc biệt nấm có chứa nhiều loại vitamine như B12, B2 Ngoài
ra nấm còn có tác dụng chữa một số loại bệnh. Với những giá trị và tác dụng như trên nấm được xem là loại thức ăn an toàn dành cho người. Những năm gần đây, phong trào nuôi trồng nấm phát triển mạnh. Nhà nhà trồng nấm. Người người trồng
nấm. Gặp lúc thời tiết thuận lợi, nấm ra hàng loạt tiêu thụ và không tránh khỏi cảnh “dội chợ”, hàng trăm ký nấm bị đổ đi vì không thể giữ lâu được. Chính vì vậy vẫn dựa trên phương pháp sản xuất nước mắm cổ truyền và nguyên tắc sử dụng nguồn
hệ vi sinh vật phân lập từ chượp mắm, enzyme từ dứa và nguồn nguyên liệu nấm để sản xuất ra sản phẩm nước mắm chay. Từ những ý tưởng trên, được sự cho phép của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hương mắm đặc trưng và ứng dụng vào sản xuất nước mắm chay từ nấm.
1.2.Mục đích, nội dung và giới hạn đề tài.
1.2.1.Mục đích.
Tuyển chọn các vi khuẩn sinh protease và gây hương từ các chủng vi khuẩn đã được phân lập qua khảo sát khả năng phân giải đạm và gây hương trong dịch chiết nấm rơm.
Ứng dụng các chủng vi sinh vật sinh protease và gây hương để chế biến nước mắm chay ngắn ngày từ nguyên liệu nấm rơm và nấm bào ngư làm đa dạng sản phẩm nước mắm, tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, đáp ứng nhu cầu an toàn thực phẩm.
1.2.2.Nội dung nghiên cứu.
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chượp mắm. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập được trong chượp mắm trên môi trường nước chiết nấm rơm.
Tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh protease qua khảo sát khả năng thủy phân protein của các chủng vi sinh vật phân lập trong chượp mắm trên nguyên liệu nước chiếtt nấm rơm.
Khảo sát khả năng gây hương của các chủng vi sinh vật phân lập trong chượp mắm trên nguyên liệu nước chiết nấm rơm.
Sản xuất thử nghiệm nước mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập và tuyển chọn được.
1.2.3. Giới hạn đề tài.
Đề tài chỉ bước đầu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh thủy phân tốt và gây hương mắm đặc trưng trên dịch chiết nấm rơm từ đó ứng dụng vào sản xuất nước mắm chay ở quy mô phòng thí nghiệm. Do thiếu hóa chất để thực hiện một số phản ứng sinh hóa nên đề tài chỉ dừng lại ở mức định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn.
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Khái quát về nước mắm.
2.1.1. Giới thiệu.
Nước mắm được sản xuất bằng cách cho phân giải protein của cá dưới tác dụng của các enzyme có sẵn trong thịt và ruột cá. Cho cá vào hủ sành với lượng muối đầy đủ, phơi trộn và để 6 – 12 tháng. Mắm cá đang muối được gọi là chượp. Khi chượp chín đem lọc (hoặc đem nấu rồi lọc ta được nước mắm). (Lê Xuân Phương, 2001).
Nước mắm có truyền thống từ lâu đời và cho đến nay chưa có tài liệu nào xác định được thời điểm chính xác cũng như ai là người đầu tiên đưa ra quy trình sản xuất sản phẩm này, chỉ biết rằng nó đã gắn liền với đời sống hằng ngày, mang nét
đặc trưng rất riêng, là sản phẩm truyền thống của dân tộc Việt Nam (Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, 1990).
Nghề nước mắm đã có những chuyển biến rõ rệt từ màu sắc, mùi vị và thời gian tạo ra sản phẩm rút ngắn từ 9 – 12 tháng còn lại khoảng 2 – 3 tháng. Năm 1914, Rose đánh giá phẩm chất của nước mắm theo các chỉ số hóa học:
Đạm toàn phần tính theo g/l.
Đạm hữu cơ = đạm toàn phần - đạm amoniac.
Đạm amin = đạm formol - đạm amoniac.
2.1.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành nước mắm:
Lượng nước cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình thủy phân nhanh hơn. Lượng nước cho vào trong quá trình thủy phân, theo kinh nghiệm của các xí nghiệp sản xuất nước chấm cho thấy lượng nước cho vào thủy phân tốt nhất là 30 – 40% so với nguyên liệu, khi cho nước vào nên cho 5 – 10% muối NaCl và duy trì nhiệt độ thủy phân 54o C – 58o C trong suốt thời gian lên men là 64 – 72 giờ. ( Nguyễn Đức Lượng, 2006)
Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nước chấm, thiếu muối nước chấm sẽ không hình thành được.
Yêu cầu của muối trong quá trình sản xuất nước chấm phải là muối ăn (NaCl), muối càng tinh khiết càng tốt. Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, có độ rắn cao, màu trắng óng ánh không đóng cục, không có vị đắng chát. Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein nhanh hơn, tạo thành acid amin nhiều hơn. Nồng độ muối cao có tác dụng ức chế, làm mất hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài.
Thường lượng muối cho vào quá trình lên men khoảng 20 – 25% so với lượng nước. Nên thực hiện phương pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác định số lần cho muối vào và khoảng cách giữa các lần cho muối để không ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Nồng độ muối ảnh hưởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Nồng độ muối cao sẽ ức chế vi sinh vật phát triển. Còn nồng độ muối thấp thì mốc dễ dàng phát triển cùng với một số vi khuẩn gây thối phát triển và làm hư sản phẩm.
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng để phát huy tác dụng tích cực của các loại enzyme. Trong quá trình chế biến, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng của các enzyme sẽ tăng, nhưng nhiệt độ tăng cao quá sẽ ức chế enzyme và quá trình thuỷ phân sẽ giảm. Vì enzyme mang bản chất là protein nên chúng không chịu được nhiệt độ cao. Nhiệt độ thích hợp cho các enzyme hoạt động từ 45o C – 54o C.
Ngoài ra nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ nhất định, do đó ta cần tạo một nhiệt độ tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh trưởng, từ đó vi sinh vật sẽ tiết ra nhiều enzyme và quá trình thuỷ phân protein thành acid amin nhanh hơn. Mỗi hệ enzyme có pH tối thiểu khác nhau vì vậy phải xem loại enzyme nào
nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất nước chấm.
Từ đó, ta tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động. Qua thực nghiệm cho thấy pH môi trường tự nhiên có pH = 4 – 5 thích hợp cho quá trình lên men. Đồng thời, ở pH này còn có tác dụng ức chế vi khuẩn gây thối phát triển.
Nước bổi có vi khuẩn, men tiêu hóa được xem như dung môi hòa tan các chất do sự phân giải cá hình thành để chống vi khuẩn bên ngoài xâm nhập khối thịt cá. Trong nước mắm có chứa rất nhiều loại vi khuẩn hiếu khí: gồm Escherichia
coli, Paracoli, Aerobacter, Bacillus subtilius .vi khuẩn gây bệnh: với tỉ lệ 1% như Staphilococcus aureus, vi khuẩn yếm khí: Clostridium Tonkimeirs, Clostridium welchii, Eubacterium; nấm mốc: Aspergillus Penicillium, Mucor; nấm men: Trichoderma, Tropicalis
Năm 1930, Boer và Guiller đã tách được từ nước mắm một loại vi khuẩn kị khí sinh bào nha là Clostridium. Loại này cấy trong môi trường thạch pepton sẽ sản sinh ra hương vị của nước mắm.
Thêm chượp chín cũng có tác dụng rút ngắn ¼ - ½ thời gian trong điều kiện 36o C – 44o C. Đồng thời phải cho muối từ nhạt đến mặn dần để lợi dụng khả năng lên men ban đầu của vi sinh vật, không làm ức chế các men hoạt động. Áp dụng phương pháp cho muối nhiều lần sẽ phân giải nhanh hơn cho muối 1 lần. Nguyên liệu được băm, nghiền, đập dập có tác dụng rút ngắn được thời gian chế biến chượp hơn cá nguyên con. Nghề nước mắm hiện nay ở Việt Nam vẫn sản xuất theo phương pháp cổ truyền quá trình sản xuất thô sơ, thời gian kéo dài và hiệu quả kinh tế thấp. Đã có nhiều công trình nghiên cứu để cơ giới hóa nghề nước mắm nhưng còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế vì sự ăn mòn của muối đối với kim loại.
2.1.3.Giá trị dinh dưỡng của nước mắm.
2.2.Cơ chế quá trình hình thành nước mắm.
Quá trình hình thành nước mắm gồm 2 quá trình cơ bản:
2.2.1.Quá trình chuyển hóa protid thành acid amin.
Quá trình thủy phân protit của cá thành acid amin, peptit nhờ enzyme protease của cá hệ sinh vật có trong ruột cá hay vi sinh vật bên ngoài tác dụng vào qua các dạng trung gian như peptin, polypeptit, peptit, và cuối cùng là acid amin. Protein > polypeptid > acid amin Nếu quá trình xảy ra mạnh sẽ dẫn đến các sản phẩm cuối cùng là acid amin và 1 số loại khí có mùi rất khó chịu như: H2, NH3, Các sản phẩm này làm giảm chất lượng nước mắm, bay hơi tạo mùi khó chịu. Những vi sinh vật tiết ra enzyme protease thúc đẩy quá trình thủy phân xảy ra nhanh hơn. Bên cạnh đó các vi sinh vật gây thối có tác dụng ngược lại làm nát thịt cá và gây thối sản phẩm, những vi sinh vật này xuất hiện có khi ở giai đoạn đầu hay trong trong quá trình chế biến nếu không khống chế kịp thời sau khi tạo thành nước mắm cũng dễ bị thối do vi sinh vật gây nên.
2.2.2.Quá trình tạo hương thơm.
Đây là một quá trình phức tạp, đòi hỏi phải có thời gian nhất định để sản phẩm tích lũy năng lượng đặc trưng do sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ tạo thành hương thơm.
Nước mắm là một dung dịch mà trong đó không chỉ có acid amin, nước, muối, vitamine và các chất khoáng mà phải có loại hương thơm đặc trưng của nó. Do đó nếu thiếu quá trình này thì nước mắm không còn là nước mắm mà chỉ là dung dịch
acid amin thuần túy. Cho đến nay vẫn chưa có sự giải thích rõ ràng nào về sự tạo hương nước mắm, nhiều người cho rằng các sản phẩm thủy phân trong quá trình kết hợp với nhau mà sinh hương, một số khác thì cho ràng là do hoạt động của vi khuẩn lactid hoặc vi khuẩn thuộc giống Clostridium như công trình nghiên cứu cùa Boer và Guiller (1930), Creach và Koskopull (1940)
2.3.Quy trình sản xuất nước mắm.
2.3.1.Quy trình sản xuất nước mắm dài ngày.
Đây là phương pháp làm nước mắm thủ công, quá trình này thường kéo dài 12 – 14 tháng để làm chuyển hóa protein của cá thành acid amin rùi đem lọc và nấu nước mắm. Ở mỗi vùng mỗi địa phương có phương pháp làm khác nhau nhưng ta có thể tóm tắt quy trình tổng quát như sau :
.
MỤC LỤC
1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích, nội dung và giới hạn đề tài 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Nội dung nghiên cứu . 2
1.2.3. Giới hạn đề tài . 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
2.1. Khái quát về nước mắm . 4
2.1.1 Giới thiệu 4
2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành nước mắm . 4
2.1.3 Giá trị dinh dưỡng của nước mắm . 7
2.2. Cơ chế hình thành nước mắm 7
2.2.1. Quá trình chuyển hóa protid thành acid amin . 7
2.2.2. Quá trình tạo hương thơm . 8
2.3. Quy trình sản xuất nước mắm 8
2.3.1. Quy trình sản xuất nước mắm dài ngày 8
2.3.2. Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày . 10
2.4. Giá trị dinh dưỡng của nấm ăn . 13
2.5. Sự phân giải của enzyme 18
2.5.1. Phân loại protease . 18
2.5.2. Một số nguồn enzyme được sử dụng 19
2.5.2.1. Protease từ vi sinh vật 19
2.5.2.2.Protease từ thực vật – enzyme bromelin . 20
3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
3.1. Thời gian và địa điểm . 21
3.2. Nguyên vật liệu thí nghiệm 21
3.2.1. Nguyên liệu . 21
3.2.2. Vật liệu 21
3.2.3. Môi trường sử dụng . 22
3.2.2. Hóa chất sử dụng . 22
3.3. Nội dung và phương pháp tiến hành thí nghiệm 23
3.4. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hương đặc trưng nước mắm . 23
3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chượp mắm 23
3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường nước chiết nấm rơm . 25
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường nước chiết nấm rơm 26
3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng sinh hương của các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường nước chiết nấm rơm . 27
3.5. Sản xuất nước mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lậpđược . 29
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
4.1. Kết quả quá trình phân lập, tuyển chọn các hủnh vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hương đặc trưng nước mắm . 32
4.1.1 Kết quả quá trình phân lập các chủng vi sinh vật 32
4.1.1.1 Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn hiếu khí 32
4.1.1.2. Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn kị khí . 35
4.1.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập được . 37
4.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường nước chiết nấm rơm 40
4.1.4. Kết quả khảo sát khả năng sinh hương của các chủng vi sinh vật phân lậpđược . 43
4.2. Kết quả sản xuất nước mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập được 44
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 56
5.1. Kết luận 56
5.2. Đề nghị . 57
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 68
7. PHỤ LỤC