Thạc Sĩ Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing và đối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
Tp.Hồ Chí Minh, 2012


Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Mục lục . iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt viii
Danh mục các bảng .ix
Danh mục các hình vẽ x
Danh mục các đồ thị xi

MỞ ĐẦU . 1
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic .4

1.1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới . 4
1.1.2 Tình hình nghiên cứu probiotic tại Việt Nam 6
1.2 Tình hình dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7
1.2.1 Bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7
1.2.1.1 Lịch sử phát hiện tác nhân gây bệnh 7
1.2.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri . 8
1.2.1.3 Triệu chứng lâm sàng . 8
1.2.1.4 Đường lây truyền 10
1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn 10
1.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn
10
1.2.2.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn . 10
1.2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra . 12
1.2.3.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra 12

1.2.3.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra . 12
1.3 Giới thiệu về probiotic . 13
1.3.1 Định nghĩa probiotic 14
1.3.2 Đặc điểm của probiotic 15
1.3.3 Vai trò của Probiotic 15
1.3.4 Cơ chế tác động của probiotic . 16
1.3.4.1 Tác động đối kháng . 16
1.3.4.2 Cải thiện chất lượng nước . 17
1.3.4.3 Tăng cường hệ miễn dịch 18
1.3.4.4 Ảnh hưởng đến sự sinh trưởng . 19
1.3.4.5 Sự hình thành quần thể trong ruột (Gut colonization) . 20
1.4 Cơ chế hoạt đông của hệ thống “ Quorum sensing” ở vi khuẩn gây bệnh.
21
1.4.1 Định nghĩa quá trình “Quorum sensing” . 22
1.4.2 Hệ thống “Quorum sensing” của Edwardsiella spp. 22
1.4.3 Sự phân hủy sinh học quá trình “Quorum sensing” của vi khuẩn gây bệnh 23
1.4.3.1 Enzyme AHL lactonase 23
1.4.3.2 Enzyme AHL acylase 24

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 26
2.2 Địa điểm thu mẫu 26
2.3 Vật liệu nghiên cứu . 27
2.3.1 Nguồn vật liệu cho phân lập 27
2.3.2 Chủng vi khuẩn 29
2.3.3 Môi trường và hóa chất . 29
2.4 Phương pháp nghiên cứu 30
2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu . 30
2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử AHL (phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở vi khuẩn Edwardsiella ictaluri) . 31
2.4.3 Thử khả năng phân hủy phân tử HHL (N-hexanoyl homoserine lactone) của các chủng vi khuẩn phân lập được ở điều kiện in vitro. .32
2.4.3.1 Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và
đường kính vòng tròn sắc tố violacein 32
2.4.3.2 Khảo sát đặc tính phân hủy HHL của các chủng vi khuẩn phân lập ở điều kiện in vitro . 33
2.4.4 Khảo sát đặc tính đối kháng với Edwardsiella ictaluri trong điều kiện
in vitro . 34
2.4.4.1 Phương pháp đường vuông góc (Cross Streak) . 34
2.4.4.2 Phương pháp thạch khuếch tán (modified agar well-diffusion method) . 35
2.4.4.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (Disc-diffusion method) 36
2.4.4.4 Phương pháp BLIS (Bacteriocin-like inhibitory substance) . 36
2.4.5 Thử khả năng gây bệnh cho người và động vật . 37
2.4.6 Thử khả năng đối kháng với một số chủng kiểm định . 38
2.4.7 Thử nghiệm các đặc tính sinh học in vitro của các chủng vi khuẩn đã
được tuyển chọn 38
2.4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển
chọn 38
2.4.7.2 Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn
. 38
2.4.7.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn 39
2.4.7.4 Khả năng chịu pH dạ dày 39
2.4.7.5 Khả năng chịu muối mật . 40

2.4.8 Định danh vi khuẩn sử dụng phương pháp truyền thống và giải trình tự gen 16S rRNA 41
2.4.8.1 Định danh vi khuẩn sử dụng phương pháp truyền thống . 41
2.4.8.2 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S
rRNA . 47
2.4.9 Thử khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn đã được chọn 48
2.5 Xử lý kết quả . 49

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu AHL ở vi khuẩn Edwarsiella ictaluri . 50
3.1.1 Số lượng dòng vi khuẩn thu được qua các đợt phân lập . 50
3.1.2 Biến động giá trị pH của hỗn dịch vi khuẩn trong quá trình phân lập
. 51
3.1.3 Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn qua quá trình phân lập 52
3.1.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc sau quá trình phân lập . 52
3.2 Khả năng phân hủy phân tử HHL bởi các dòng vi khuẩn đã được chọn lọc 53
3.3 Khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri 54
3.3.1 Phương pháp thạch khuếch tán 54
3.3.2 Các phương pháp khác 56
3.4 Kết quả thử khả năng sinh hemolysin . 59
3.5 Kết quả thử khả năng đối kháng với một số chủng vi khuẩn kiểm định 61
3.6 Kết quả thử một số đặc tính sinh học in vitro của các chủng vi khuẩn tuyển chọn . 62
3.6.1 Đường cong tăng trưởng 63
3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 64
3.6.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối 65
3.6.4 Ảnh hưởng của pH . 65

3.6.5 Khả năng chịu pH dạ dày . 66
3.6.6 Khả năng chịu muối mật . 68
3.7 Kết quả định danh . 71
3.7.1 Định danh bằng hình thái và các phản ứng sinh hóa . 71
3.7.2 Định danh bằng sinh học phân tử . 74
3.8 Kết quả thử khả năng tương thích lẫn nhau 74
3.9 Bàn luận 74

Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận . 80
4.2 Kiến nghị . 81
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC






DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic đối kháng vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản . 5
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của probiotic lên sự phát triển của ấu trùng cá biển trong điều kiện in vitro 19
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic lên sự hình thành quần thể và khả năng bám dính trong ruột cá . 21
Bảng 2.1. Số lượng mẫu thu được qua bốn đợt . 28
Bảng 3.1. Số lượng dòng vi khuẩn thu được sau khi nuôi cấy trong môi trường chứa hỗn hợp phân tử AHL 50
Bảng 3.2. Khả năng phân hủy HHL của những dòng vi khuẩn đã được phân lập . 53
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
bằng phương pháp thạch khuếch tán 54
Bảng 3.4. Tỉ lệ % mẫu có khuẩn lạc đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.55
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với Edw. ictaluri bởi các dòng vi khuẩn khảo sát bằng bốn phương pháp 57
Bảng 3.6. Kết quả thử khả năng sinh hemolysin . 59
Bảng 3.7. Tổng hợp các đặc tính của các chủng vi khuẩn được sàng lọc: khả năng phân hủy HHL, đối kháng Edw. ictaluri và sinh hemolysin 60
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp đường vuông góc. 62
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp thạch khuếch tán
. 62
Bảng 3.10. Kết quả nhuộm gram . 71
Bảng 3.11. Kết quả định danh 4 chủng vi khuẩn gram âm bằng Kit API 20E 72
Bảng 3.12. Kết quả định danh 2 chủng vi khuẩn gram dương bằng Kit API 50 CHL
73
Bảng 3.13. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử 74
Bảng 3.14. Thử khả năng tương thích lẫn nhau giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn
. 74


DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella ictaluri 8
Hình 1.2. Cá bệnh ESC cấp tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng (A), Cá bệnh ESC cấp tính với những đốm xuất huyết màu đỏ ở phần đầu và bụng (B) và Cá bị bệnh ESC mãn tính (C) 9
Hình 1.3. Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A), cá tra bị bệnh mủ ở gan thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B) 9
Hình 1.4. Cơ chế phân hủy phân tử AHL của enzyme AHL-lactonase và AHL- acylase 25
Hình 2.1. Dụng cụ thu mẫu nước hình (a), mẫu bùn (b) 27
Sơ đồ 2.1. Qui trình nghiên cứu của đề tài 30
Sơ đồ 2.2. Qui trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân tử AHL 31
Hình 2.2. Các vòng sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện của phân tử HHL 33
Hình 2.3. Phương pháp đường vuông góc . 35
Hình 2. 4. Cách làm chết vi khuẩn bằng chloroform 37
Hình 2.5. Thử khả năng tương thích bằng phương pháp thạch khuếch tán 49
Hình 3.1. Hình thái các khuẩn lạc phân lập từ mẫu nước ở cuối chu kỳ 4 (a) và mẫu bùn ở cuối chu kỳ 4 (b) trên môi trường BHIA . 53
Hình 3.2. Thử khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn khảo sát bằng phương pháp đường vuông góc (a), thạch khuếch tán (b), đĩa giấy khuếch tán (c), BLIS (d) .
. 56
Hình 3.3. Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59
Hình 3.4. Thử khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp
đường vuông góc 61
Hình 3.5. Kết quả nhuộm gram T1DT101(a), T1DT103(b), G1DT102(c), G2VL1.2(d), B4TAG19A(e), N4TAG22a1(f) . 71



DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1. Biến động giá trị pH của hệ vi sinh từ các mẫu phân lập khác nhau qua bốn chu kỳ 51
Đồ thị 3.2. Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn trong các hỗn hợp vi sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước và bùn ao nuôi cá tra qua bốn chu kỳ 52
Đồ thị 3.3. Đường cong tăng trưởng chủng T1DT101 (a), T1DT103 (b), G1DT102 (c), G2VL1.2 (d), B4TAG19A (e), N4TAG22a1(f) 63
Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 64
Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 65
Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 66
Đồ thị 3.7. Tỉ lệ sống (%) của các chủng vi khuẩn khảo sát theo thời gian ở pH3(a), pH2(b) 67
Đồ thị 3.8. Tỉ lệ sống (%) của các chủng vi khuẩn khảo sát theo thời gian ở nồng độ
muối mật 0,5% (a), 1% (b), 2% (c) 69




MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản đang phát triển nhanh và là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn, đóng góp rất lớn cho xuất khẩu. Theo FAO (2008), sản lượng nuôi trồng thủy sản của Việt Nam đạt gần 1,7 triệu tấn, có giá trị khoảng 3,3 tỉ USD trong năm 2006. Trong đó, sản lượng nuôi trồng thủy sản nước ngọt ước tính khoảng 1,51 triệu tấn, giá trị khoảng 3,17 tỉ USD. Trong các loài cá nuôi nước ngọt, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) loài cá nuôi nước ngọt truyền thống, là một đối tượng xuất khẩu với nhiều mặt hàng chế biến được xuất sang hơn 80 nước trên thế giới. Cá tra được nuôi phổ biến trong ao, lồng bè, đăng quần với mức độ thâm canh, bán thâm canh và qui mô nông hộ ở hầu hết các tỉnh Nam Bộ, trong đó tập trung chủ yếu ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ Sản lượng cá tra ước tính đạt khoảng 300.000 tấn (năm 2004), đạt 400.000 tấn (năm 2005), đạt 800.000 tấn (năm 2006), đạt 1.000.000 tấn (năm 2007), 1.128.014 tấn (năm 2008) và 1,2 triệu tấn (năm 2009), tổng sản lượng năm 2010 là 1,141 triệu tấn, kim ngạch xuất khuẩu đạt 1,44 tỉ USD [1]. Trong vòng 10 năm phát triển, sản lượng xuất khẩu của cá tra từ 7.000 tấn, giá trị 20 triệu USD (năm 1997) tăng lên 286.000 tấn, giá trị 737 triệu USD (năm 2006) và 1,2 tỉ USD trong năm 2008. Qua số liệu thống kê cho thấy rằng cá tra là loài cá xuất khẩu chiến lược của Việt Nam trong những năm tiếp theo. Kỹ thuật nuôi thâm canh đã giúp cải thiện đáng kể năng suất trong nuôi trồng thủy sản nói chung và cá tra nói riêng. Tuy nhiên, bên cạnh đó, nó cũng đồng thời tạo ra sự ô nhiễm môi trường, dịch bệnh ngày càng nhiều và khó điều trị. Bệnh cá tra chủ yếu do vi khuẩn và ký sinh trùng gây nên và có thể gây chết lên đến 70-80% [9]. Để phòng ngừa và điều trị bệnh, hầu hết nông dân dùng thuốc kháng sinh để trị bệnh cá tra. Với sự lạm dụng sử dụng thuốc kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc và dư lượng thuốc kháng sinh trong các sản phẩm chế biến từ cá tra. Để thay thế dần phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immunostimulants), chế phẩm sinh học (probiotic). Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên cá tra vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm.


Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus, nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc cho cá. Những thành công đáng chú ý là việc sử dụng các chất tăng cường hệ miễn dịch vừa có phổ phòng ngừa bệnh rộng vừa thân thiện với môi trường. Hơn thế nữa, phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) được mong đợi và trở thành công cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh vật gây bệnh. Đặc biệt là các vi sinh vật có lợi có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” của các vi khuẩn gây bệnh và có khả năng làm giảm độc lực của chúng.
Trong nghiên cứu này, cách tiếp cận của đề tài là phân lập, tuyển chọn những chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra, có khả năng đối kháng và phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Đây là cách tiếp cận mới hiện nay về nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản nhằm kiểm soát dịch bệnh do vi khuẩn gây nên. Đề tài thành công là kết quả bước đầu chọn ra các dòng vi khuẩn có những đặc tính ưu việt, làm nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học ứng dụng cho các ao nuôi cá tra nhằm giảm thiểu dịch bệnh gây rủi ro cho người nuôi.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ ĐẶC TÍNH PHÂN HỦY PHÂN TỬ TÍN HIỆU ‘‘QUORUM SENSING” VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ (Edwardsiella ictaluri) TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) ”
Mục tiêu:

Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu ‘‘Quorum sensing” và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri) trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).



- Nội dung nghiên cứu

+ Sàng lọc những chủng vi khuẩn từ các mẫu hệ tiêu hóa cá tra thịt và cá tra giống; nước và bùn ở đáy các ao nuôi cá tra ở một vài tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở Edwardsiella ictaluri và cũng đối kháng với vi khuẩn này.
+ Thử khả năng gây bệnh cho người, động vật và khả năng đối kháng với một số chủng kiểm định.
+ Khảo sát một số đặc tính sinh học của những chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn và khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn.
+ Định danh các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn bằng phương pháp truyền thống và giải trình tự gen 16S rRNA.

Ý nghĩa thưc tiễn

+Tạo ra sản phẩm probiotic nội địa giá thành rẻ nhưng hiệu quả cao.
+ Giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và rủi ro cho người nuôi cá tra do bệnh gan thận mủ gây nên, đồng thời tăng chất lượng thịt phi lê cá đáp ứng yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm của cá tra xuất khẩu.