Luận Văn Phân lập tế bào gốc trung mô từ dây rốn trẻ sơ sinh

MỞ ĐẦU
Những nghiên cứu mở rộng về tế bào gốc người đã trở thành một lĩnh vực ngày càng nhận được sự quan tâm trong suốt một thập kỷ qua. Việc sử dụng tế bào gốc người đã cung cấp một công cụ hiệu quả và đa dạng các phương pháp điều trị một số bệnh trong y học. Một nỗ lực là việc tìm kiếm tế bào gốc đa tiềm năng trong các mô trưởng thành và tránh vấn đề về đạo đức cũng như là vấn đề tạo khối u khi sử dụng tế bào gốc phôi người.
Một loại tế bào gốc đa tiềm năng là tế bào gốc trung mô đã trở thành ứng viên cho một số ứng dụng trong liệu pháp thay thế và sửa chữa tế bào cũng như công nghệ mô trong y học tái tạo nhờ vào tiềm năng biệt hóa đa dạng của nó. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) là tế bào có khả năng tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào trung mô khác nhau bao gồm tế bào mỡ, xương, sụn và gân. Hơn thế, các nhà khoa học còn tìm ra được điều kiện cảm ứng đặc hiệu để biệt hóa MSCs thành các dòng tế bào không phải trung mô như tế bào gan, thận, cơ tim, thần kinh. MSCs có thể được phân lập và nhân lên trong điều kiện ex vivo mà không làm thay đổi đáng kể về kiểu hình và đặc tính của chúng.
Trước đây, tủy xương là nguồn chính để phân lập MSCs cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như lâm sàng. Tuy nhiên, phân lập MSCs từ tủy xương gặp một số hạn chế nhất định. Do đó, các nhà khoa học đã và đang tiến hành tìm kiếm các nguồn phân lập MSCs thay thế. Ngoài tủy xương, MSCs có thể được phân lập từ các nguồn như: một số cơ quan và máu của bào thai trước sinh, dịch ối và dây rốn. Trong đó, dây rốn là nguồn phân lập MSCs có tiềm năng nhất vì đã khắc phục được các hạn chế gặp phải khi phân lập MSCs từ tủy xương. Hơn thế, dây rốn là nguồn cung cấp MSCs rất dồi dào và luôn sẵn có vì chúng là rác thải sinh học sau khi em bé ra đời.
MSCs có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau trong dây rốn, đó là máu, Wharton’s jelly (lớp mô đệm của dây rốn), màng lót và lớp nội mô tĩnh mạch dây rốn. Trong số đó, phân lập MSCs từ tĩnh mạch dây rốn là hướng đi mới nhất và đang được nghiên cứu rộng rãi.
MSC được phân lập từ các nguồn khác nhau không đại diện cho một quần thể tế bào đồng nhất. Hiện nay, vẫn chưa có cách nào đơn giản để xác định MSC bằng một dấu hiêu đơn nhất. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá sự thuần nhất của quần thể tế bào gốc trung mô được phân lập từ lớp lót trong tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh trong nuôi cấy in vitro“ nhằm đánh giá sự biểu hiện các marker bề mặt của MSC trong từng giai đoạn nuôi cấy từ đó chủ động nguồn tế bào gốc trung mô phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 3
1.1.1. Định nghĩa tế bào gốc trung mô. 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc trung mô. 3
1.1.3. Các nguồn thu nhận MSC 5
1.1.4. Các đặc điểm của MSC 6
1.1.4.1. Khả năng tự đổi mới 6
1.1.4.2. Chỉ thị bề mặt của MSC 7
1.1.4.3. Tiềm năng biệt hóa của MSC 9
1.1.5. Ứng dụng của tế bào gốc trung mô. 11
1.1.5.1. Các bệnh về tim 12
1.1.5.2. Các bệnh về xương. 12
1.1.5.3. Các bệnh về sụn. 13
1.1.5.4. Các bệnh về gân. 13
1.1.5.5. Các bệnh về thần kinh. 14
1.1.5.6. Điều trị bỏng và tái tạo da. 14
1.1.6. Nghiên cứu MSC ở Việt Nam 14
1.2. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TĨNH MẠCH DÂY RỐN 15
1.2.1. Cấu trúc dây rốn. 15
1.2.2. Tế bào gốc trung mô từ tĩnh mạch dây rốn. 16
1.3. FLOW CYTOMETRY VÀ ÚNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TẾ BÀO 18
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu Flow cytometry. 18
1.3.2. Hệ thống Flow cytometry và nguyên tắc hoạt động. 20
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, VẬT TƯ, THIẾT BỊ 22
2.2.1. Dụng cụ vật tư tiêu hao. 22
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu. 23
2.2.3. Hóa chất 24
2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy tế bào. 25
2.2.3.2. Các dung dịch Enzyme. 25
2.2.3.3. Các dung dịch khác. 25
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.3.1. Quy trình thí nghiệm 26
2.3.2. Thu nhận dây rốn. 27
2.3.3. Phân lập MSC từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn. 27
2.3.4. Phương pháp phủ gelatin lên bề mặt nuôi cấy. 29
2.3.5. Phương pháp nuôi cấy chọn lọc MSC 30
2.3.6. Phương pháp cấy chuyển tế bào. 30
2.3.7. Phương pháp phân tích tế bào bằng Flow Cytometry. 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY NGUYÊN PHÁT 32
3.1.1. Kết quả phân lập và đánh giá độ thuần nhất của quần thể tế bào khi mới được phân lập. 32
3.1.2. Kết quả nuôi cấy chọn lọc quần thể tế bào. 35
3.2. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY THỨ PHÁT 37
3.2.1. Kết quả nuôi cấy và đánh giá độ thuần nhất của quần thể tế bào sau lần cấy chuyển thứ nhất (16 ngày). 37
3.2.2. Kết quả đánh giá chất lượng quần thể tế bào gốc trung mô sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro (40 ngày). 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
KẾT LUẬN 41
KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42