Luận Văn Phân lập, giải trình tự và xây dựng gen S10 của Southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV) gâ

Đề tài: Phân lập, giải trình tự và xây dựng gen S10 của Southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV) gây bệnh lùn sọc đen phương nam ở Việt nam trên vector biểu hiện pET-28a(+)



MỤC LỤC​

Lời cảm ơn. i

Mục lục. ii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng. vi

Danh mục hình. vii

Tóm tắt ix

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề. 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục đích. 2

1.2.2 Yêu cầu. 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về họ Reoviridae. 3

2.1.1 Giới thiệu. 3

2.1.2 Cấu trúc. 3

2.2 Sơ lược về chi Fijivirus. 4

2.2.1 Giới thiệu. 4

2.2.2 Cấu trúc phân tử. 4

2.2.3 Genome. 5

2.2.4 Sự tái bản. 6

2.2.5 Dịch bệnh học. 6

2.3 Sơ lược về Southern rice black streaked dwarf virus. 7

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước. 12

PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Đối tượng nghiên cứu. 16

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu. 16

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu. 16

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 16

3.3 Vật liệu nghiên cứu. 16

3.4 Phương pháp nghiên cứu. 17

3.4.1 Thiết kế mồi để phân lập gen S10. 17

3.4.2 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh. 17

3.4.3 Phân lập gen S10 bằng kỹ thuật RT-PCR 18

3.4.4 Điện di sản phẩm RT-PCR trên Agarose gel 1 % . 18

3.4.5 Tinh chiết sản phẩm RT-PCR 18

3.4.6 Nối gen phân lập được vào vector nhân dòng pTZ57R/T 18

3.4.7 Nhân dòng plasmid nhờ kỹ thuật biến nạp vào E. coli dòng XL1 blue. 18

3.4.8 Kiểm tra các khuẩn lạc có chứa gen quan tâm 19

3.4.9 Xác định trình tự gen phân lập trên các dòng cloning. 19

3.4.10 Phân tích sequence. 19

3.4.11 Chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn (miniprep) 20

3.4.12 Thiết kế vector tái tổ hợp gen S10 trên pET-28a(+). 20

3.4.13 Nghiên cứu biểu hiện gen S10 trong tế bào vi khuẩn E. coli dòng BL21(DE3). 20

3.4.14 Kiểm tra kết quả biểu hiện protein bằng điện di SDS-PAGE (Biorad). 20

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Xây dựng cấu trúc biểu hiện gen S10 – SRBSDV 21

4.1.1 Phân lập gen S10 bằng kỹ thuật RT-PCR 21

4.1.2 Biến nạp gen vào vi khuẩn nhân dòng E. coli chủng XL1-Blue. 22

4.1.3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp sau biến nạp. 24

4.1.4 Giải trình tự ORF S10. 25

4.1.5 Xây dựng cấu truc biểu hiện gen S10 trên vector biểu hiện pET-28a(+). 25

4.1.6 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào dòng biểu hiện E. coli chủng BL21(DE3). 28

4.2 Biểu hiện protein S10 tái tổ hợp. 31

4.2.1 Cơ chế điều hòa biểu hiện. 31

4.2.2 Biểu hiện S10 bằng tự cảm ứng trong điều kiện chuẩn khác nhau. 33

4.2.3 Biểu hiện S10 bằng tự cảm ứng trong điều kiện nhiệt độ và thời gian lắc khác nhau 36

4.2.4 Cảm ứng biểu hiện protein S10 tái tổ hợp bằng IPTG 37

4.2.5 Thảo luận kết quả biểu hiện. 39

4.3 Đặc trưng phân tử của gen S10 phân lập từ bốn tỉnh. 42

4.3.1 Kết quả biên tập trình tự chuỗi 42

4.3.2 Tìm kiếm chuỗi tương đồng trên GenBank. 42

4.3.3 So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide. 44

4.3.4 So sánh khoảng cách di truyền chuỗi dựa trên trình tự nucleotide. 45

4.3.5 Phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide của gen S10. 47

4.4 Dự đoán epitope và thiết kế mồi tổng hợp peptide tái tổ hợp của gen S10. 49

4.4.1 Dự đoán epitope tế bào B 50

4.4.2 Chọn vùng chứa epitope và thiết kế mồi 51

4.4.3 Thiết kế mồi 51

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 53

5.1 Kết luận. 53

5.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 55

PHỤ LỤC 59