Báo Cáo Phân lập, giải trình tự và xây dựng gen p6 của Rice grassy stunt virus Việt Nam vào vector biểu hiện

Đề tài: Phân lập, giải trình tự và xây dựng gen p6 của Rice grassy stunt virus Việt Nam vào vector biểu hiện pET28a(+)


MỤC LỤC
PHẦN I MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề. 1
1.2. Mục đích. 2
1.3. Yêu cầu. 2
PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Tình hình nghiên cứu về RGSV trên thế giới và ở Việt Nam. 3
2.1.1. Tình hình nghiên cứu về RGSV trên thế giới 3
2.1.2. Tình hình nghiên cứu về RGSV ơ Việt Nam 3
2.2. Tình hình dịch bệnh vàng lùn ở nước ta. 4
2.3. Giới thiệu chung về RGSV và chi Tenuivirus. 5
2.4. Phổ kí chủ, triệu chứng bệnh và mức độ gây hại của RGSV. 5
2.4.1. Phổ kí chủ. 5
2.4.2. Triệu chứng bệnh. 6
2.4.3. Tác hại 7
2.5. Cơ chế truyền bệnh của RGSV 7
2.5.1. Rầy nâu- vector truyền bệnh. 7
2.5.2. Sơ đồ cơ chế truyền bệnh qua rầy nâu. 9
2.6. Các dòng virus, cấu trúc thể virus và cấu trúc phân tử bộ gen RGSV 9
2.6.1. Các dòng virus. 9
2.6.2. Cấu trúc thể virus. 10
2.7. Cấu trúc phân tử bộ gen RGSV, vai trò của gen p6. 10
2.7.1. Cấu trúc phân tử bộ gen RGSV. 10
2.7.2. Vai trò chức năng của gen p6. 12
2.7.3. Sự cần thiết của việc nghiên cứu trình tự gen p6. 12
2.8. Huyết thanh học. 13


2.9. Các biện pháp phòng chống RGSV. Sự cần thiết của việc sản xuất kháng huyết thanh tái tổ hợp. 13
2.9.1. Các biện pháp phòng chống RGSV 13
2.9.2. Sự cần thiết của việc sản xuất kháng huyết thanh tái tổ hợp. 13
2.10. Bản chất của phương pháp huyết thanh học và phương pháp ELISA. 14
2.10.1. Bản chất của phương pháp huyết thanh học. 14
2.10.2. Bản chất của phương pháp ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) 15
2.11. Các bước chính trong sản xuất kháng huyết thanh taí tổ hợp và ý nghĩa của việc xây dựng gen p6 của RGSV trên vector biểu hiện pET28a(+) 15
2.12. Các kỹ thuật nền cơ bản. 16
2.12.1. Chiết tách RNA tổng số. 16
2.12.2. RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain Reaction) 17
2.12.3. Tạo Plasmit tái tổ hợp. 18
2.12.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn. 20
2.12.5. Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp. 20
2.12.6. Kỹ thuật PCR 21
2.12.7. Kỹ thuật xác định trình tự. 22
PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu. 23
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu. 23
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu. 23
3.1.3. Thời gian nghiên cứu. 23
3.1.4. Vật liệu nghiên cứu. 23
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. 23
3.2.1. Nội dung 1: Kiểm tra nguồn bệnh bằng ELISA 23
3.2.2. Nội dung 2: Chiết RNA tổng số. 25
3.2.3. Nội dung 3 : Chạy RT-PCR 26
3.2.4. Chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm RT-PCR. 27


3.2.5. Tinh chiết sản phẩm RT-PCR từ gel agarose bằng pure LinhTM Quick gel Extraetion Kit. 28
3.2.6. Cắt sản phẩm RT-PCR bằng hai Enzym cắt giới hạn BamHI và XholI. 29
3.2.7. Tinh sạch sản phẩm cắt của gen p6 bằng Pure Link TM PCR Puri Fication Kit 29
3.2.8. Nuôi cấy dòng vi khuẩn XLI-Blue pET 28a(+) và chiết tách để thu lấy plasmid pET 28a(+). 30
3.2.9. Tinh sạch DNA plasmid, thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid bằng 2 enzym cắt giới hạn BamHI và XholI, tinh sạch sản phẩm cắt. 33
3.2.10. Nối gen p6 (đã cắt) vào pET28a(+) (đã cắt) và tinh sạch sản phẩm nối. 33
3.2.12. Transform pET 28a(+) có chứa gen p6 vào tế bào khả biến. 35
3.2.13. Kiểm tra kết quả transform. 36
3.2.14. Phương pháp giải trình tự gen. 37
3.2.15. Xử lý trình tự thu được. 37
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
4.1. Kết quả thử ELISA virus. 38
4.2. Kết quả chiết tách RNA tổng số, kết quả RT-PCR 40
4.2.1. Chiết tách RNA tổng số. 40
4.2.2. Kết quả RT-PCR 41
4.4. Kết quả tinh sạch gen p6 từ gel agarose. 43
4.5. Kết quả giải trình tự gen p6. 45
4.6. Kết quả cắt và tinh sạch sản phẩm cắt gen p6. 45
4.7. Kết quả cắt và tinh sạch sản phẩm cắt vector pET28a(+) 45
4.8. Kết quả nối sản phẩm cắt gen p6 vào vector biểu hiện. 45
4.9. Kết quả transform 45
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46