Thạc Sĩ Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị
kinh tế, dinh dưỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệp và có tác dụng cải
tạo đất trồng và bảo vệ môi trường. Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu
tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của
giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác
động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ
bị nhiễm nhiều loại virus, như virus gây bệnh khảm lá (Soybean mosaic virus
– SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus –
BYMV) và một số virus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những
loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương.
SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp là
môi giới và virus có thể truyền qua hạt. Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có
những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng,
đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít và
biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV
gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương.
Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi
ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [87]. Việc
nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và
chất lượng hạt [95].
Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp
phòng mà vẫn chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Do đó các
biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh
đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt
trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả 2
thấp và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV
và BYMV là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh, nhưng nguồn giống
đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính
vì vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan
tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây
bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi).
RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng dụng
để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất hoạt
gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi
trong chiến lược tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập
đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen
mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tạo được dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm trên cây
đậu tương bằng kỹ thuật RNAi.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm ở cây đậu
tương Việt Nam.
(ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của
SMV và cả hai loài SMV và BYMV.
(iii) Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng
kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen;
(iv) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi . 3
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi và
nhân đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV. Phân
tích sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen
CP phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân
hàng gen quốc tế.
3.2. Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV
phân lập từ nhiều nguồn khác nhau. Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và
tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP.
3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của
SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway. Biến nạp
vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A. tumefaciens.
3.4. Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của đoạn
gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ
thuật PCR. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen
so với cây đối chứng không chuyển gen.
3.5. Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A. tumefaciens.
Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương
chuyển gen.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước 720
nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV đã
được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103.
4.2. Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả
năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và
BYMV. 4
4.3. Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả
năng kháng cả hai loài SMV và BYMV.
4.4. Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và
DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây
chuyển gen từ giống DT2008.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Về khoa học
Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi
chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả hai loài SMV,
BYMV để tạo được cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với SMV và
BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen đã khẳng định cơ sở khoa
học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ chính
loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây chuyển gen kháng
virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi.
5.2. Về thực tiễn
Kết quả lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương
đã tổn thương và tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc
RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV đã cho thấy khả năng ứng
dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ thuật RNAi trong chọn tạo giống đậu tương ở
Việt Nam.
Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen CPi của SMV và
BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo được cây chuyển gen đối với
thuốc lá và đậu tương đã khẳng định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
RNAi và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng
ở Việt Nam.

5
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
1.1.1. Cây đậu tương và bệnh virus ở cây đậu tương
Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill (2n = 40)
thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae). Đậu tương là
loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất. Hạt đậu
tương chứa khoảng 40% protein, 20% lipid và chứa nhiều chất quan trọng cho
hoạt động sinh lý của cơ thể người và động vật, như: isoflavone, lecithin,
tocopherol và saponin. Thêm nữa hạt đậu tương còn chứa nhiều protein chức
năng và là nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trò trong chăm sóc và bảo vệ sức
khỏe con người [149], [158]. Các sản phẩm từ đậu tương đã tăng lên đáng kể
so với các loại cây trồng khác do nhu cầu về protein và dầu [82].
Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây
hàng năm. Rễ của cây đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên. Rễ
tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm. Trên rễ có
nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm
[1]. Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều
lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò. Cành đậu
tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá
mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang
một lá kép. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ
nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm,
có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn
tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng
và nhiệt độ [1], [2]. Quả đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có
lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen. Quả thẳng 6
hoặc hơi cong. Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt. Hạt đậu
tương có nhiều hình dạng như bầu dục, tròn dài, tròn dẹt. Vỏ hạt thường nhẵn
và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen nhưng đa số là hạt màu
vàng. Khối lượng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt và khối lượng 1000 hạt
dao động trung bình 100-200g. Hình dạng và màu sắc rốn hạt là dấu hiệu đặc
trưng cho mỗi giống đậu tương [1], [2].
Với những giá trị kinh tế và giá trị sử dụng, đậu tương được xem là loại
cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tư
chỉ sau lúa, ngô và lúa mỳ. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu
và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước
đang được chú trọng, diện tích gieo trồng vì thế đã tăng lên đáng kể. Đậu
tương được trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp, ở 28 tỉnh thành trên khắp cả nước,
trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam. Cây đậu tương ở nước ta
được trồng chủ yếu ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ (khoảng
65%) và 35% được trồng ở những vùng đất thấp, ở khu vực đồng bằng sông
Hồng. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, từ năm 2008 đến nay, diện tích
trồng, năng suất và sản lượng đậu tương không có sự tăng đáng kể so với
những năm trước. Nguồn giống đậu tương kháng bệnh và chống chịu cao là
một trong các nguyên nhân chính có thể giải thích cho sự phát triển chậm của
ngành sản xuất đậu tương ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ
sinh học nhằm cải thiện tính kháng bệnh của cây đậu tương là cách tiếp cận
mới, có hiệu quả đối với ngành chọn giống đậu tương hiện nay.
Cây đậu tương có thể mắc một số bệnh do vi khuẩn, nấm hoặc virus,
như bệnh khảm do SMV hoặc BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm
Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm
Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc
Fusarium solani fsp. Phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số
bệnh hại khác. Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại