Thạc Sĩ Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cell

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ
TP. HỒ CHÍ MINH, 06/2011

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 1

1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose . 1
1.1.1. Cấu trúc của cellulose 1
1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật 2
1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase 3
1.2.1. Nấm mốc 3
1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase . 5
1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase 7
1.3.1. Đặc điểm chung 7
1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên 7
1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe . 7
1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose . 8
1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng 10
1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình 10
1.4. Hệ thống enzym cellulase . 12
1.4.1. Thành phần của cellulase . 12
1.4.2. Cơ chế thủy giải cellulose 13
1.4.3. Ứng dụng enzyme cellulase . 14
1.4.4. Hệ thống cellulase không phức hợp . 15
1.4.5. Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp 16
1.4.5.1. Đặc điểm chung . 16
1.4.5.2. Cấu trúc cellulosome . 18

1.4.5.3. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 20
1.4.5.4. Sự sắp xếp của cellulosome 22
1.4.5.5. Sự điều hòa nguồn carbon . 24
1.5. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase 25
1.6. Phương pháp định danh sinh học phân tử 26

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1. Vật liệu . 29
2.1.1. Nguồn phân lập 29
2.1.2. Thiết bị dụng cụ . 29
2.1.2.1. Thiết bị thông dụng . 29
2.1.2.2. Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí . 29
2.1.2.3. Môi trường . 30
2.1.2.4. Hóa chất 31
2.1.2.5. Chủng vi khuẩn đối chứng . 35
2.2. Phương pháp thực hiện . 35
2.1.1. Phương pháp tạo môi trường kị khí 35
2.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase . 36
2.2.2. Đặc tính sinh lí hình thái vi khuẩn . 37
2.2.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc 37
2.2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram 37
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử 38
2.2.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS . 39
2.2.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc 41
2.2.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ 41
2.2.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào . 42
2.2.3.4. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số 43
2.2.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase 44
2.2.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide 45

2.2.3.6.1. Lượng protein tối ưu thủy phân CMC 47
2.2.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein A và protein B . 47
2.2.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của các chủng . 47
2.2.3.7. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase . 48
2.2.3.8. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase . 48
2.2.3.8.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 48
2.2.3.8.2. Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase . 48
2.2.4. Định danh vi khuẩn 49
2.2.4.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium 50
2.2.4.2. Phản ứng PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại loài . 51

3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN . 52

3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase . 52
3.2. Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 54
3.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc 54
3.2.2. Nhuộm Gram 55
3.2.3. Nhuộm bào tử 56
3.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS . 57
3.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc . 57
3.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ . 58
3.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào . 59
3.3.4. Xác định hoạt tính cellulase tổng số 60
3.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC . 62
3.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide
64
3.3.6.1. Nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC . 64
3.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein B và protein A 65
3.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của 6 chủng khảo sát 68
3.4. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase . 71

3.5. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase 73
3.5.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 73
3.5.2. Ảnh hưởnng pH lên hoạt tính cellulase . 74
3.6. Định danh vi khuẩn . 75
3.6.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium . 76
3.6.2. PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại 77


4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

4.1. Kết luận 81
4.2. Kiến nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 6


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc 57
Biểu đồ 3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ 58
Biểu đồ 3.3. Nồng độ protein ngoại bào của các chủng 59
Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng . 61
Biểu đồ 3.5. Sự tương quan giữa lg(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn với
Rf 67
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 72
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính celluase . 73
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính celluase . 85


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật . 3
Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum 9
Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình . 11
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của hệ enzym cellulase của Trichoderma reesei 13
Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum . 18
Hình 1.6. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 21
Hình 1.7. Cấu trúc của phức hợp Coh-XDoc loại II của loài C. thermocellum 23
Hình 2.1. Quy trình thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi universal . 52
Hình 3.1. Vòng phân giải cellulose của mẫu DR5 và DM7 . 53
Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng DR5-1 . 54
Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram chủng TQ1-2 55
Hình 3.4. Kết quả nhuộm bào tử chủng DR5-1 56
Hình 3.5. Vòng phân CMC của dung dịch protein B và protein A của TQ1-2 62
Hình 3.6. Vạch phân giải CMC trên gel với lượng protein khác nhau của dung dịch Protein B chủng TQ1-2 64
Hình 3.7a. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 . 66
Hình 3.7b. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2 66
Hình 3.8a. Vạch phân giải CMC của dung dịch Protein B và protein A chủng
DM5-1, DM7-1, DR5-1 . 69
Hình 3.8b. Vạch phân giải CMC của dung dịch ProteinB và protein A chủng
DM8-1, DT2-1, TQ1-2 . 69
Hình 3.9. Sản phẩm PCR cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21.

Hình 3.10. Sản phẩm PCR cặp mồi universal . 77
Hình 3.11. Cây phân loại loài của các chủng khảo sát 80


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose 5
Bảng 1.2. Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome . 17
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 54
Bảng 3.2. Nhuộm Gram và khảo sát các đặc điểm hình thái tế bào 55
Bảng 3.3. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng . 61
Bảng 3.4. Hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC 62
Bảng 3.5. Trọng lượng phân tử của các vạch protein trên SDS-PAGE 68
Bảng 3.6. Trọng lượng phân tử của các vạch protein phân giải CMC trên gel . 70



1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose
1.1.1. Cấu trúc của cellulose
Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên kết bởi β-1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật và là nguồn carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên. Mức độ polimer hóa thường từ 100 đến 20.000. Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43].
Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được cấu trúc thành những sợi cellulose. Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng như liên kết hydrogen nội phân tử. Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X [23].
Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong những vị trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác. Chúng có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhập không chỉ enzym mà thậm chí những phân tử nhỏ như nước. Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu trúc tinh thể đã dẫn đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình. Sợi cellulose còn có những cấu trúc bất quy tắc khác như: những chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một số mạch nhỏ. Tổng diện tích tiếp xúc của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể trong cấu trúc cùng kích thước. Sự không đồng nhất trong cấu trúc làm cho sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi trường lỏng và cho phép sự xâm nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzym thủy phân cellulose [23].
Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 25oC. Trong khi, quá trình phân hủy sinh học thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [43].


1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật

Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng một nửa nguồn carbon trong sinh quyển. Người ta ước tính rằng lượng carbon được thực vật đồng hóa hàng năm khoảng 200 tỷ tấn [29]. Khoảng 70% sinh khối thực vật được cấu thành từ các đơn vị đường chứa 5, 6 carbon [27]. Phân tử cellulose kết hợp thành những sợi có cấu trúc tinh thể hình thành nên bộ khung cho vách tế bào thực vật. Sợi cellulose được liên kết chéo với các polysaccharide khác gọi là hemicellulose để làm tăng độ bền cho vách tế bào. Hemicellulose bao gồm xylan (đơn phân -D-xylose với liên kết -
1,4-), glucomannan (đơn phân -D-mannose và -D-glucose với liên kết -1,4-), xyloglucan (đơn phân -D- glucose với liên kết 1,4-, và -D-xylose và -D-glucose với liên kết -1,6-), 1,3-1,4-glucan (đơn phân -D-glucose với liên kết -1,3- và -1,4-), và số lượng nhỏ polysaccharide khác bao gồm -D-glucose, -D-xylose, -D-mannose và đơn vị đường khác với các liên kết khác nhau. Bộ khung cellulose và hemicellulose còn được liên kết với pectin (đơn phân -D-galacturonic acid với liên kết chủ yếu -1,4-), với chức năng là chất gắn trong vách tế bào [23].
Thành phần và cấu trúc của vách tế bào có sự khác biệt lớn giữa các loài thực vật, hàm lượng cellulose thông thường chiếm từ 35 đến 50% trọng lượng khô thực vật. Trong một số trường hợp, sợi cellulose được gắn vào mạng lưới các sợi sinh học khác, chủ yếu là hemicellulose chiếm khoảng 20 đến 35% và lignin chiếm khoảng đến 30% trọng lượng khô thực vật [23].
Lignin, hiện diện cùng với cellulose trong nhiều loài thực vật giúp làm cứng vách tế bào thực vật. Các loại thực vật khác nhau thì có thành phần lignin khác nhau. Tuy nhiên, sự hiện diện của lignin ngăn cản sự chuyển đổi các polysaccharide thành các đơn phân dưới tác động của enzym [6].