Thạc Sĩ Phân Lập, Định Danh Và Xác Định Đặc Điểm Sinh Hóa Của Các Chủng Vi Khuẩn Kị Khí, Ưa Nhiệt, Sinh Cell

LỜI MỞ ĐẦU

Vấn đề năng lượng, môi trường, và phát triển bền vững đang là thách thức to lớn trong thời đại chúng ta [24]. Với sự cạn kiệt của nguồn nhiên liệu hóa thạch và gia tăng nhu cầu tìm kiếm nguồn nhiên liệu thay thế, sự quan tâm nghiên cứu cellulase đã được bắt đầu trong những thập kỉ gần đây cho ứng dụng chuyển đổi sinh khối thực vật thành nhiên liệu sinh học. Sự sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật đã và đang được xem như là phương thức tiềm năng cho nguồn nhiên liệu tái sinh và phát triển bền vững [37].
Sinh khối thực vật phù hợp cho những ứng dụng năng lượng bền vững bởi vì chúng tồn tại phong phú trong tự nhiên, chi phí sản xuất thấp và thân thiện với môi trường. Đặc biệt, sự sản xuất và chu trình năng lượng từ sinh khối thực vật không ảnh hưởng đến tác động hiệu ứng nhà kính. Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất cho việc mở rộng sản xuất năng lượng từ sinh khối thực vật đó là do chi phí sản xuất cao[24].
Quá trình chuyển đổi sinh khối do sự thủy giải của enzym và vi sinh vật được thực hiện qua bốn quá trình chuyển đổi: sản xuất cellulase và hemicellulase; sự thủy giải các đường đa trong sinh khối đã được tiền xử lý thành đuờng đơn; sự lên men đường hexose (glucose, mannose và galactose); và sự lên men đường pentose (xylose and arabinose). Thực hiện riêng lẻ từng quá trình này tốn nhiều chi phí, công sức và thời gian nên không khả thi về mặt kinh tế trong sản xuất công nghiệp. Tuy nhiên, bốn quá trình chuyển đổi này có thể xảy ra trong một quá trình thống
nhất gọi là Consolidated Bioprocessing (CBP). Sự sản xuất ethanol là ứng dụng chủ
yếu của quá trình CBP ngày nay.
Quá trình CBP được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ cao, kị khí giúp thủy giải lignin từ sinh khối thực vật dễ dàng, không gây bất lợi cho quá trình thủy giải enzym và không gây tạp nhiễm đã cho thấy những ưu điểm triển vọng lớn trong sản xuất công nghiệp. Tuy nhiên, việc tìm kiếm một chủng vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt, kị khí sinh cellulase là khó khăn lớn thực hiện quá trình này.
Những nghiên cứu gần đây đã chọn lọc được chủng sử dụng cellulose chịu nhiệt kị khí thuộc loài C. thermocellum trong tự nhiên [24].
Trước yêu cầu trên cùng với sự định hướng của giảng viên hướng dẫn, em đã thực hiện đề tài “Phân Lập, Định Danh Và Xác Định Đặc Điểm Sinh Hóa Của Các Chủng Vi Khuẩn Kị Khí, Ưa Nhiệt, Sinh Cellulase” với mục tiêu:
o Phân lập vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase từ những nguồn phân lập đất mùn, đất ruộng, phân trùng quế
o Khảo sát các đặc tính sinh lý, hình thái của khuẩn lạc và tế bào của các chủng phân lập
o Khảo sát đặc điểm sinh hóa, hoạt tính cellulase trên môi trường PCS
o Định danh các chủng vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
LỜI MỞ ĐẦU
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1
1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose .1
1.1.1. Cấu trúc của cellulose 1
1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật 2
1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase 3
1.2.1. Nấm mốc 3
1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase .5
1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase 7
1.3.1. Đặc điểm chung 7
1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên 7
1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe .7
1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose .8
1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng 10
1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình 10
1.4. Hệ thống enzym cellulase .12
1.4.1. Thành phần của cellulase .12
1.4.2. Cơ chế thủy giải cellulose 13
1.4.3. Ứng dụng enzyme cellulase .14
1.4.4. Hệ thống cellulase không phức hợp .15
1.4.5. Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp 16
1.4.5.1. Đặc điểm chung .16
1.4.5.2. Cấu trúc cellulosome .18
1.4.5.3. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 20
1.4.5.4. Sự sắp xếp của cellulosome 22
1.4.5.5. Sự điều hòa nguồn carbon .24
1.5. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase 25
1.6. Phương pháp định danh sinh học phân tử 26
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29
2.1. Vật liệu .29
2.1.1. Nguồn phân lập 29
2.1.2. Thiết bị dụng cụ .29
2.1.2.1. Thiết bị thông dụng .29
2.1.2.2. Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí .29
2.1.2.3. Môi trường .30
2.1.2.4. Hóa chất 31
2.1.2.5. Chủng vi khuẩn đối chứng .35
2.2. Phương pháp thực hiện .35
2.1.1. Phương pháp tạo môi trường kị khí 35
2.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase .36
2.2.2. Đặc tính sinh lí hình thái vi khuẩn .37
2.2.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc 37
2.2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram 37
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử 38
2.2.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS .39
2.2.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc 41
2.2.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ 41
2.2.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào .42
2.2.3.4. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số 43
2.2.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase 44
2.2.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel
polyacrylamide 45
2.2.3.6.1. Lượng protein tối ưu thủy phân CMC 47
2.2.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein A và protein B .47
2.2.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của các chủng .47
2.2.3.7. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase .48
2.2.3.8. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase .48
2.2.3.8.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 48
2.2.3.8.2. Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase .48
2.2.4. Định danh vi khuẩn 49
2.2.4.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng
cho vi khuẩn Clostridium 50
2.2.4.2. Phản ứng PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại
loài .51
3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .52
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase .52
3.2. Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 54
3.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc 54
3.2.2. Nhuộm Gram 55
3.2.3. Nhuộm bào tử 56
3.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS .57
3.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc .57
3.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ .58
3.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào .59
3.3.4. Xác định hoạt tính cellulase tổng số 60
3.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC .62
3.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide
64
3.3.6.1. Nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC .64
3.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein B và protein A 65
3.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của 6 chủng khảo sát 68
3.4. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase .71
3.5. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase 73
3.5.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 73
3.5.2. Ảnh hưởnng pH lên hoạt tính cellulase .74
3.6. Định danh vi khuẩn .75
3.6.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi
khuẩn Clostridium .76
3.6.2. PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại 77
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81
4.1. Kết luận 81
4.2. Kiến nghị 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 6