Thạc Sĩ Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
TP.HCM – 2011

MỤC LỤC ( Luận văn dài 130 trang co file WORD)

Trang phụ bìa .i
Mục lục . ii
Danh mục chữ viết tắt v
Danh mục bảng .vi
Danh mục biểu đồ vii
Danh mục hình viii
MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
1.1.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng thủy sản 3
1.1.2 Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh cho động vật thủy sản 4
1.1.3 Các loại bệnh thường gặp trên động vật thủy sản . 6
1.1.4 Tác động tiêu cực của việc dùng thuốc trong nuôi trồng thủy sản 9
1.2 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN .
1.2.1 Định nghĩa probiotic . 13
1.2.2 Đặc điểm chung của probiotic . 14
1.2.3 Các cơ chế tác động của probiotic . 14
1.2.4 Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản . 20
1.2.5 Tình hình nghiên cứu prob iotic ứng dụng trong thủy sản ở Việt Nam và
trên thế giới 21

1.3 BẺ GÃY QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING CÁCH TIẾP CẬN MỚI
TRONG VIỆC KIỂM SOÁT HỆ VI SINH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
1.3.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing 23
1.3.2 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp
cận mới trong việc kiểm soát bệnh . 24
1.3.3 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh .
1.4 TỔNG QUAN VI KHUẨN Bacilllus . 27
1.4.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus 27
1.4.2 Dinh dưỡng và sinh trưởng . 28
1.4.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus 28
1.4.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản 30

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU . 31
2.1.1 Thời gian tiến hành . 31
2.1.2 Địa điểm tiến hành thí nghiệm . 31
2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31
2.2.1 Nguồn vật liệu phân lập và chủng vi sinh vật kiểm định . 31
2.2.2 Địa điểm thu mẫu 31
2.2.3 Môi trường - hóa chất- thiết bị - dụng cụ sử dụng 34
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 35
2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35
2.3.2 Phương pháp thu mẫu 37
2.3.3 Phương pháp phân lập . 37
2.3.4 Phương pháp chọn lọc . 38
2.3.5 Định danh các chủng tuyển chọn . 42

2.3.6 Khảo sát các đặc tính probiotic khác . 48
2.3.7 Khảo sát các đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn 51
2.3.8 Khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 55
2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU . 56

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ 57
3.1.1 Kết quả thu mẫu, phân lập và chọn lọc bước một 57
3.1.2 Kết quả sàng lọc dựa vào khả năng sinh enzyme hemolysin 58
3.1.3 Thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng thử nghiệm 61
3.1.4 Kết quả định danh các chủng đã tuyển chọn 65
3.1.5Kết quả khảo sát các đặc tính probiotickhác của các chủng tuyển chọn
3.1.6 Kết quả khảo sát một số đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn .
3.1.7 Kết quả khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 81
3.2 THẢO LUẬN . 82

Chương 4- KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN 88
4.2 ĐỀ NGHỊ 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 90
PHỤ LỤC PL1




DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu . 31
Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hemolysin . 58
Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào . 61
Bảng 3.3: Kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa . 66
Bảng 3.4: Tóm tắt kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử .
. 67
Bảng 3.5: Kết quả đối kháng của các chủng thử nghiệm với một số chủng gây bệnh
. 67
Bảng 3.6: Tốc độ phân hủy phân tử HHL bởi các chủng tuyển chọn ở thời điểm 9h và
24h . 69
Bảng 3.7: Log (cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các nồng độ muối khác nhau
sau 24 giờ . 71
Bảng 3.8: Log( cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các giá trị pH khác nhau sau
24 giờ . 73
Bảng 3.9: Log (cfu/ml) các chủng khảo sát sau 24giờ nuôi ở các nhiệt độ 74
Bảng 3.10: Tỷ lệ sống sót (%) của các chủng khảo sát ở nồng độ muối mật khác nhau
vào các thời điểm 1giờ, 2giờ, 3giờ và 6giờ . 75
Bảng 3.11: Tỷ lệ sống sót (%) của các chủng khảo sát ở pH2 và pH3 theo thời gian .
. 79
Bảng 3.12: Kết quả tương thích giữa các chủng khảo sát 81



DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ phần trăm số lượng enzyme của các chủng khảo sát 64
Biểu đồ 3.2: Mối tương quan giữa đường kính vòng violacein và Ln[HHL] . 69
Biểu đồ 3.3: Tốc độ phân hủy HHL ở thời điểm 9 giờ và 24 giờ . 70
Biểu đồ 3.4: Log(cfu/ml) của các chủng thử nghiệm ở các nồn g độ muối khác nhau sau
24 giờ . 72
Biểu đồ 3.5: Log( cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các giá trị pH4- pH10 sau
24 giờ khảo sát . 73
Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ sống sót của các chủng khảo sát theo thời gian ở nồng độ muối mật
0,5%, 1%, 2% . 77
Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ sống sót của các chủng khảo sát theo thời gian ở pH2 và pH3 . 80



DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh . 6
Hình 1.2: Vi khuẩn Aeromonas và cá tra bị xuất huyết do Aeromonas . 6
Hình 1.3: Vi khuẩn Vibrio phát sáng trên môi trường TCBS và mang tôm sú bị đen do
nhiễm Vibrio . 7
Hình 1.4: Vi khuẩn E.ictaluri và cá tra bị bệnh do nhiễm Edwardsiella 8
Hình 1.5: Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn . 25
Hình 1.6: Sự phân hủy phân tử AHL bằng enzyme . 26
Hình 1.7: Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus . 29
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm . 36
Hình 2.2. Dụng cụ thu mẫu nước và bùn của ao nuôi cá tra 37
Hình 2.3: Bảng đặc tính sinh hóa của một số chủng Bacillus . 43
Hình 2.4: Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc . 49
Hình 3.1: Sự đa dạng khuẩn lạc từ mẫu phân lập trên môi trường DSM 57
Hình 3.2:Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường DSM 57
Hình 3.3: Tế bào tạo nội bào tử và tế bào sinh dưỡng 58
Hình 3.4: Kết quả kiểm tra enzyme catalase: catalase dương tính, catalase âm tính
. 58
Hình 3.5: Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 61
Hình 3.6: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào . 65
Hình 3.7: Chủng N3.19.2 đối kháng với V.alginolyticus . 68
Hình 3.8: Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen aiiA của chủng N3.19.2 . 68
Hình 3.9: Đường kính vòng violacein ở nghiệm thức đối chứng ở các thời điểm 0 giờ,
9 giờ và 24 giờ . 70
Hình 3.10: Vòng violacein của chủng N3.10.1 ở thời điểm 9h và 24h 71




MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản là thế mạnh của nước ta, trong 10 năm gần đây ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2010, diện tích nuôi trồng thủy sản được mở rộng lên 1,1 triệu ha, sản lượng đạt 2,8 triệu tấn và giá trị xuất khẩu thủy sản đạt 5,034 tỉ USD [3]. Vấn đề dịch bệnh, năng suất và chất lượng của sản phẩm thủy sản luôn được đặt lên hàng đầu. Để quản lý dịch bệnh thì kháng sinh đã và đang là sự lựa chọn hàng đầu của nhiều hộ nuôi, hệ quả là chất lượng thủy sản giảm do hàm lượng kháng sinh tồn dư trong sản phẩm sau khi thu hoạch. Việc lạm dụng kháng sinh quá mức còn gây ra nguy cơ kháng kháng sinh của các chủng gây bệnh, khiến cho liều lượng kháng sinh sử dụng mùa sau cao hơn mùa trớưc hoặc phải sử dụng luân vòng kháng sinh gây khó khăn cho việc điều trị và kiểm soát dịch bệnh [122].
Với mục tiêu thay thế dần phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống, các phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immuno stimulants), chế phẩm sinh học như probiotic. Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên đối tượng thủy sản vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm . Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus , nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc đối với vật nuôi [117]. Do đó, phương pháp trị liệu sinh họ c bằng vi sinh vật có lợi như probiotic đang được đánh giá cao và trở thành công cụ phòng ngừa , điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh.
Hiện nay có khoảng hơn 400 thương hiệu chế phẩm sinh học đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, tuy nhiên các chế phẩm này chủ yếu có nguồn gốc ngoại nhập hoặc sản xuất trong nước, đa số chưa rõ nguồn gốc, các chủng được sử dụng làm probiotic chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Saccharomyces, Nitrobacter sp [11].

Trong số các nhóm vi sinh vật nói trên thì Bacillus là một ứng viên quan trọng cho việc sản xuất probiotic vì nhóm này có các đặc tính như: c ó khả năng sinh bào tử, và có khả năng sản sinh các sản phẩm thứ cấp như chất kháng khuẩn, enzyme, hầu hết không gây hại cho người và động vật. Enzyme của Bacillus phân cắt các hợp chất carbohydrate, lipid, protein rất hiệu quả [29], [79], [108], [120]. Vì những lý do trên, cùng sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và sự cho phép của Khoa Sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, tôi thực hiện đề tài “Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra”.