Thạc Sĩ Nuôi cấy và tạo rễ cây hoàn ngọc (Pseuderanthemum Bracteatum) trong điều kiện in-vitro để thu nhận b

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
CHUYÊN NGÀNH: SINH LÝ THỰC VẬT
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Năm 2011

MỤC LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1. CÂY HOÀN NGỌC . 2
1.1.1. Vị trí phân loại . 2
1.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố 3
1.1.3. Đặc điểm về hình thái 3
1.1.4. Thành phần hoá học . 3
1.1.5. Công dụng 5
1.2. HỢP CHẤT THỨ CẤP VÀ BETULIN . 7
1.2.1. Giới thiệu sơ lược về hợp chất thứ cấp 7
1.2.2. Ứng dụng công nghệ tế bào trong thu nhận hợp chất thứ cấp . 11
1.2.2.1. Tầm soát (screening) và chọn lọc (selection), tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
(edium ptimization) 11
1.2.2.2. Biệt hóa tế bào 12
1.2.2.3. Cố định tế bào (Immobilized cells) 14
1.2.2.4. Gợi kích thích (Elicitation) . 14
1.2.2.5. Công nghệ về con đường biến dưỡng . 15
1.2.3. BETULIN 16
1.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP . 17
1.3.1. Các hệ thống tế bào in vitro . 17
1.3.3.1. Mô sẹo 17
1.3.3.2. Biện pháp làm tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào . 18
Tối ưu hoá điều kiện môi trường . 18


PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 20

2. Vật liệu và phương pháp 20
2.1. Vật liệu . 20
2.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thực hiện đề tài . 20
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 20
2.1.3. Mẫu cấy . 20
2.1.4. Môi trường nuôi cấy 20
2.1.4.1. Môi trường chung . 20
2.1.4.2. Các loại môi trường 21
2.1.5. Điều kiện nuôi cấy . 21
2.1.6. Dụng cụ kỹ thuật 21
2.1.7. Dụng cụ và trang thiết bị và hóa chất nuôi cấy . 23
2.2 Phương pháp 24
2.2.1. Khử mẫu 24
2.2.2. Bố trí thí nghiệm 25
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch canxi hypocloric với các nồng độ khác nhau 25

2.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự phát triển chồi từ đoạn đốt thân dưới ảnh hưởng của
sự kết hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA và BA . 26
2.2.2.3. Thí nghiệm 3: Tăng sinh rễ từ những chồi thu được trên đoạn đốt thân 26
2.2.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ thân non và lá non cây in vitro 27
2.2.2.5. Thí nghiệm 5: Tái sinh rễ từ mô sẹo thân non cây hoàn ngọc . 27
2.2.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA lên khả
năng tạo chất thứ cấp betulin trong thân cây in vitro hoàn ngọc . 28
2.2.2.7. Phân tích hàm lượng betulin thu được trong các giai đoạn 29
2.2.2.8. Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch .30
2.2.3. Phương pháp thu nhận số liệu . 31
2.2.4. Bố trí thí nghiệm 31

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 32

3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch canxi
hypocloric với các nồng độ khác nhau 32
3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự phát triển chồi từ đoạn đốt thân dưới ảnh hưởng của sự
kết hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA và BA . 34
3.3. Thí nghiệm 3: Tăng sinh rễ từ những chồi thu được trên đoạn đốt thân 37
3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ thân non và lá non cây in vitro 40
3.5. Thí nghiệm 5: Tái sinh rễ từ mô sẹo thân non cây hoàn ngọc . 46
3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA lên khả năng
tạo chất thứ cấp betulin trong thân cây in vitro hoàn ngọc . 48

3.7. Phân tích hàm lượng betulin thu được trong các giai đoạn 50
3.8. Vòng vô khuẩn: thân cây in vitro hoàn ngọc được chiết bằng dung môi ethanol 96o
với tỷ lệ 1g trọng lượng khô / 100ml ethanol 96o 54
3.9. Hình thái giải phẫu mẫu rễ và thân cây hoàn ngọc in vitro phát sinh từ mô sẹo thân 55


PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 59

Kết luận 59
Kiến nghị 59



DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát sự phát sinh chồi từ đoạn đốt thân sau khi khử mẫu đạt . 21
Bảng 2: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát sự tạo mô sẹo từ đoạn đốt thân và lá in vitro của cây hoàn ngọc . 22
Bảng 3: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát ảnh hưởng của NAA trong qua trình tái sinh rễ từ mô sẹo thân cây hoàn ngọc 22
Bảng 4: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát ảnh hưởng của BA trong quá trình tái sinh cây con từ mô sẹo thân in vitro cây hoàn ngọc 23
Bảng 6: Hàm lượng betulin thu được 29
Bảng 7: Tỉ lệ mẫu bị nhiễm và tái sinh sau các thời gian và nồng độ chất khử trùng khác nhau 32
Bảng 8: Tỉ lệ mẫu tạo chồi từ đoạn đốt thân cây hoàn ngọc trên các môi trường khác nhau35
Bảng 9: Hàm lượng betulin trong các cơ quan cây hoàn ngọc 38
Bảng 10: Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D kết hợp với BA lên sự tạo mô sẹo từ thân non cây hoàn ngọc in vitro 41
Bảng 11: Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D kết hợp với BA lên sự tạo mô sẹo từ lá non cây hoàn ngọc in vitro 43
Bảng 12: Chiều dài rễ và số rễ chính của cây in vitro được nhân sinh khối ở các môi trường khác nhau 46
Bảng 13: Sự tăng sinh cây con in vitro 48


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Tỷ lệ sống và tái sinh đoạn đốt thân cây hoàn ngọc 33
Biểu đồ 2: Tỷ lệ mẫu tạo chồi từ đoạn đốt thân cây hoàn ngọc 35
Biểu đồ 3: So sánh hàm lượng betulin trong các cơ quan cây hoàn ngọc in vitro và ngoài tự nhiên . 39
Biểu đồ 4: Sự tạo mô sẹo từ thân non cây hoàn ngọc in vitro . 41
Biểu đồ 5: Sự tạo mô sẹo từ lá non cây hoàn ngọc in vitro . 43
Biểu đồ 6: Chiều dài rễ và số rễ chính được biệt hóa từ mô sẹo thân non in vitro . 47
Biểu đồ 7: Sự tăng sinh cây con in vitro từ mô sẹo . 49
Biểu đồ 8: Biểu đồ betulin thu được trong các giai đoạn 51


DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Cây hoàn ngọc trồng trong chậu tại Đà Nẵng 2
Hình 2. Sơ đồ: Con đường sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa bậc hai ở tế bào thực vật . 8
Hình 3. Mối quan hệ giữa các chất nhất cấp và chất thứ cấp ở thực vật 10
Hình 4. Lông rễ được tạo thành trong nuôi cấy rễ cây Atropa belladonna 13
Hình 5. Khung cơ bản của betulin . 16
Hình 6: Mẫu cấy 20
Hình 7: Các đoạn đốt thân cây hoàn ngọc sống và tái sinh . 34
Hình 8: Các đoạn đốt thân cây hoàn ngọc không nhiễm nhưng không tái sinh 34
Hình 9: Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự phát sinh chồi từ đoạn đốt thân cây hoàn ngọc . 36
Hình 10: Cây con phát triển sau 12 tuần nuôi cấy . 37
Hình 11: Mô sẹo hình thành từ đoạn thân non phát triển tốt . 42
Hình 12: Mô sẹo hình thành từ đoạn thân non bị hóa nâu 42
Hình 13: Mô sẹo hình thành từ lá in vitro cây hoàn ngọc . 44
Hình 14 : Rễ được biệt hóa từ mô sẹo thân non cây in vitro . 47
Hình 15: Cây con in vitro tái sinh từ mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy . 49

Hình 16: Cây con in vitro tái sinh từ mô sẹo sau 12 tuần nuôi cấy . 50
Hình 17: Đối chứng – dung môi ethanol 96o . 54
Hình 18: Vòng kháng khuẩn do betulin 54
Hình 19: Hình giải phẫu rễ cây 55
Hình 20: Hình giải phẫu thân non cây hoàn ngọc . 56



ĐẶT VẤN ĐỀ


+ Loài người biết dùng lá và rễ cây làm thuốc từ thời kỳ xa xưa. Y học dân gian cổ truyền của các dân tộc cũng có nhiều kinh nghiệm trong việc dùng lá, thân và rễ cây hoàn ngọc để chữa nhiều bệnh trong đó có công dụng chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Các nhà khoa học cũng có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng chữa bệnh của cây hoàn ngọc ngoài tự nhiên nhưng nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy cây hoàn ngọc in-vitro và sinh tổng hợp betulin, hợp chất thứ cấp có hàm lượng cao trong cây thì rất hạn chế.
+ Loại dùng trong chữa bệnh trong dân gian miền Nam: có hình lá xoan nhọn, ngắn, màu xanh nhạt, thân đứng, cao khoảng 0.5-1m, có tên khoa học là Pseuderanthemum palatiferum (Nees), Radlk, thuộc họ Ôrô (Acanthaceae)[4]. Tiến sỹ Trần Công Khánh cho biết, đã có nghiên cứu, sơ bộ xác định trong lá hoàn ngọc có chứa Sterol, coumarin, đường khử, carotenoid và acid hữu cơ. Thuốc này được ghi nhận trong dân gian, nhưng mới sử dụng điều trị bệnh trong thời gian gần đây, nên chưa được đúc kết kinh nghiệm, cần có thời gian và các phương pháp nghiên cứu khoa học kiểm chứng mới có thể đưa ra kết luận cụ thể.
+ Loại dùng chữa bệnh trong dân gian miền Trung: cây hoàn ngọc đỏ còn có tên cây xuân hoa lá hoa (Pseuderanthemum bracteatum), là cây bụi, cao từ 0,6 - 1,5m, sống nhiều năm. Khi còn non, thân trơn nhẵn, mầu hơi vàng hồng, lá đơn, nguyên, mọc đối, cuống lá dài, phiến lá hình mũi mác[23].
+ Nhằm chứng minh vai trò kháng khuẩn của cây hoàn ngọc đỏ và tìm kiếm những cây thuốc có thể thay thế kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn do đó đề tài được nghiên cứu.
Vậy cây hoàn ngọc đỏ (tía) có khả năng kháng khuẩn so với các chất kinh điển như thế nào, liệu nguyên liệu nuôi cấy in-vitro từ cây hoàn ngọc có tác dụng như cây trồng tự nhiên hay không, điều này cần được khảo sát và nghiên cứu. Hợp chất thứ cấp cụ thể cần quan tâm là betulin. Có thể điều chỉnh tăng hàm lượng betulin trong nuôi cấy mô không, đây là điểm cần khảo sát.