Luận Văn Nhân giống lan hồ điệp Phalaenopsis sản phẩm bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Tis - tempor

MỤC LỤC
Nội dung Trang

LỜI CAM ĐOAN .
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . vii
DANH MỤC BẢNG . viii
DANH MỤC HÌNH . x
DANH MỤC ĐỒ THỊ xii
LỜI MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục đích nghiên cứu 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu . 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu . 3
5. Phương pháp nghiên cứu 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro . 5
1.1.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro.
. 5
1.1.2. Các bước nhân giống in vitro 6
1.1.3. Các kỹ thuật nuôi cấy in vitro 6
1.1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân . 6
1.1.3.2. Nuôi cấy chồi bên 6
1.1.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 6
1.1.3.4. Nuôi cấy mô sẹo 7
1.1.3.5. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7
1.1.3.6. Nuôi cấy thể đơn bội 7
1.1.3.7. Nuôi cấy protoplast (tế bào trần) 8
1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro . 8
1.1.4.1. Ưu điểm . 8
1.1.4.2. Nhược điểm 9
1.2. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới và ở Việt Nam 9
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới . 9
1.2.2. Tình hình sản xuất hoa Lan ở Việt Nam 11
1.3. Giới thiệu về Lan Hồ Điệp . 12
1.3.1. Nguồn gốc và phân bố . 12
1.3.2. Phân loại khoa học . 15
1.3.3. Đặc điểm hình thái . 16
1.3.3.1. Cơ quan sinh dưỡng . 18
1.3.3.2. Cơ quan sinh sản . 18
1.3.4. Điều kiện sinh thái của Lan Hồ Điệp 20
1.3.4.1. Nhiệt độ . 20
1.3.4.2. Độ ẩm 20
1.3.4.3. Ánh sáng . 20
1.3.4.4. Độ thông thoáng 21
1.3.4.5. Nhu cầu nước tưới 21
1.3.4.6. Dinh dưỡng 22
1.3.4.7. Một số sâu bệnh và cách phòng trị 22
1.3.4.8. Chậu, giá thể và cách trồng 24
1.3.5. Giá trị kinh tế và tình hình sản xuất Lan Hồ Điệp . 24
1.3.5.1. Giá trị kinh tế của Lan Hồ Điệp . 24
1.3.5.2. Tình hình sản xuất Lan Hồ Điệp 26
1.3.6. Các phương pháp nhân giống Lan Hồ Điệp . 28
1.3.6.1. Phương pháp nhân giống truyền thống 28
1.3.6.2. Phương pháp nhân giống hiện đại 30
1.4. Giới thiệu hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS . 32
1.4.1. Giới thiệu . 32
1.4.2. Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống . 33
1.4.3. Phân loại hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời . 34
1.4.3.1. Hệ thống thùng nghiêng và hệ thống Rocker 35
1.4.3.2. Hệ thống ngập hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng 35
1.4.3.3. Hệ thống ngập một phần và cơ chế thay mới môi trường
dinh dưỡng 36
1.4.3.4. Hệ thống ngập hoàn toàn có sự vận chuyển môi trường lỏng bằng áp lực không khí và không có sự thay mới môi trường 37
1.4.4. Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời . 38
1.4.4.1. Hệ thống RITA[SUP]®[/SUP] . 38
1.4.4.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT[SUP]®[/SUP] 39
1.4.4.3. Hệ thống Plantima[SUP]®[/SUP] 40
1.4.5. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống trên thế giới và ở Việt Nam . 42
1.4.5.1. Thành tựu trên thế giới 42
1.4.5.2. Thành tựu ở Việt Nam 46
1.4.6. Ưu và nhược điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
. 47
1.4.6.1. Ưu điểm 47
1.4.6.2. Nhược điểm 48
1.5. Môi trường nuôi cấy in vitro 49
1.5.1. Vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy 49
1.5.2. Một số môi trường thường được dùng trong nuôi cấy in vitro
. 49
1.5.3. Thành phần các chất khoáng vô cơ 50
1.5.3.1. Khoáng đa lượng 50
1.5.3.2. Khoáng vi lượng 52
1.5.4. Carbon và nguồn năng lượng . 54
1.5.5. Vitamin 55
1.5.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 55
1.5.7. Một số yếu tố khác trong môi trường nuôi cấy mô Lan . 55
1.5.7.1. Các chất hấp phụ phenol . 55
1.5.7.2. Nước dừa và các dịch chiết khác 56
1.5.7.3. Yếu tố làm đặc môi trường 57
1.5.7.4 . Ảnh hưởng của pH 58
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 59
2.1. Địa điểm thí nghiệm . 59
2.2. Vật liệu nghiên cứu 59
2.2.1. Vật liệu 59
2.2.2. Môi trường nuôi cấy 61
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm 61
2.3. Phương pháp nghiên cứu 61
2.3.1. Cách pha môi trường . 61
2.3.1.1. Cách pha dung dịch mẹ 61
2.3.1.2. Cách pha môi trường cấy . 62
2.3.2. Hấp khử trùng . 62
2.3.2.1. Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy . 62
2.3.2.2. Hấp khử trùng dụng cụ nuôi cấy 62
2.3.3. Các thao tác trong phòng cấy 63
2.3.4. Cách bố trí thí nghiệm . 64
2.3.4.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích
hợp để vi nhân giống . 64
2.3.4.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan . 67
2.3.4.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan . 68
2.4. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu . 69
2.5. Chuyển cây con ra vườn ươm . 69
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70
3.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống 70
3.1.1. Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân nhanh PLB 70
3.1.1.1. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá 70
3.1.1.2. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu để nhân nhanh PLB 74
3.1.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB
79
3.1.2. Thí nghiệm 1.2: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB 83
3.1.3. Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của chồi Lan Hồ Điệp . 87
3.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan 89
3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan 93
3.3.1. Thí nghiệm 3.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima . 93
3.3.2. Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập lên quá trình nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima 101
3.4. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây Hồ Điệp ngoài vườn ươm 106
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 109
4.1. Kết luận 109
4.1.1. Thiết lập môi trường vi nhân giống 109
4.1.2. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây lan Hồ Điệp lai Dtps. Taida Salu cho phép đưa ra các kết luận sau 109
4.2. Đề nghị 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 111
PHỤ LỤC . 118

LỜI MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Hiện nay Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) nói chung với các loại Lan khác nói riêng được xem là cây trồng đem lại nhiều hiệu quả kinh tế cao; do đó đã có nhiều nhà vườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ lúa, hoa màu sang trồng Lan và đạt hiệu quả kinh tế cao gấp 2 - 3 lần so với cây trồng khác. Lan Hồ Điệp là một trong những loài Lan quý đang rất được ưa chuộng và đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp hoa cắt cành cũng như cây cảnh trên thế giới. Chúng không chỉ đẹp về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một vẻ đẹp sang trọng và trang nhã.
Tuy nhiên, số lượng sản xuất cây Lan hiện nay vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Nguyên nhân do Lan Hồ Điệp là loài sinh trưởng chậm và là một loài Lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện vườn ươm. Để có được số lượng lớn cây giống chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất còn gặp nhiều khó khăn. Hiện tại có một số trường Đại Học, Viện nghiên cứu có hướng phát triển trên những kỹ thuật mới như: Bioreactor, Nuôi cấy quang tự dưỡng nhưng vẫn chưa được áp dụng rộng rãi.
Trong những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đối với cây Lan Hồ Điệp nhằm tạo cây giống sạch bệnh rất được quan tâm. Tuy nhiên phương pháp này thực hiện khó thành công vì đỉnh sinh trưởng quá nhỏ nên không thể tái sinh hoặc chết đi qua các lần khử trùng. Lan Hồ Điệp là loại Lan đơn thân, thân ngắn và mỗi cây cho một đỉnh sinh trưởng nên để có nguồn mẫu in vitro cần phải có nhiều mẫu ban đầu làm tăng chi phí quá trình nuôi cấy. Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới thường dùng phát hoa làm vật liệu nuôi cấy, phát hoa Lan Hồ Điệp có chứa các mắt ngủ có thể tạo thành chồi. Do đó, phương pháp nuôi cấy phát hoa in vitro để tạo chồi được xem là đặc trưng ở Lan Hồ Điệp nhưng hệ số nhân giống từ phương pháp này cũng rất thấp.
Gần đây, các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được nhiều nước trên thế giới triển khai và ứng dụng trong nhân giống nhiều loại cây trồng. Hệ thống này có tác dụng làm tăng cường sức sống của chồi và tăng khả năng tạo phôi soma, phôi được tạo ra không bị biến dị; loại bỏ được hiện tượng thủy tinh thể khi nuôi cấy lỏng. Thực vật được nhân giống trong hệ thống ngập chìm có khả năng thích nghi tốt hơn trong giai đoạn thuần hóa ngoài vườn ươm so với các thực vật được nuôi cấy trong hệ thống bán rắn hay lỏng.
Việc ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống hoa kiểng đặc biệt là Lan Hồ Điệp ở Việt Nam chỉ mới được ứng dụng trong thời gian gần đây. Với mục đích là khảo sát khả năng ứng dụng hệ thống này trong nâng cao số lượng cũng như chất lượng của cây giống Lan Hồ Điệp khi so sánh với các hệ thống nuôi cấy thông thường Th.S. Cung Hoàng Phi Phượng và các cộng sự đã ứng dụng thành công hệ thống góp phần mở ra khả năng sản xuất với số lượng lớn cây giống có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường tại Việt Nam.
Để từng bước áp dụng công nghệ mới trong sản xuất cây Lan giống ở nước ta, đẩy nhanh tiến độ sản xuất cây giống theo qui mô công nghiệp, góp phần khắc phục sự thiếu hụt cây giống trên thị trường. Qua đề tài "NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP PHALAENOPSIS SP. BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TIS – Temporary Immersion System)" với mong muốn có thể tìm hiểu rõ về kỹ thuật nuôi cấy này cũng như những ưu điểm nhân giống Lan Hồ Điệp bằng nuôi cấy ngập chìm so với những phương pháp nuôi cấy khác.
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá, đồng thời tìm môi trường thích hợp cho sự ra rễ của các chồi Lan Hồ Điệp nhằm thiết lập nhân nhanh giống cây Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp. bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary Immersion System).
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu nồng độ các khoáng đa lượng trong môi trường MS và ảnh hưởng của nồng độ và loại đường lên sự nhân nhanh PLB của Lan Hồ Điệp. Qua đó khảo sát việc nhân nhanh PLB bằng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Plantima của Đài Loan trên đối tượng Phalaenopsis Dtps. Taida Salu.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
Ý nghĩa khoa học:
Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS thuộc dạng bioreator đơn giản. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã xác định việc áp dụng công nghệ TIS trong vi nhân giống cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao, chất lượng cây giống tốt, nâng cao hệ số nhân chồi gấp 3 - 20 lần so với phương pháp nhân truyền thống, rút ngắn được thời gian nuôi cấy trong phòng, góp phần làm giảm giá thành sản phẩm cây giống.
Ý nghĩa thực tiễn:
Áp dụng hệ thống TIS trong vi nhân giống hoa Lan ở nước ta là một công nghệ mới, nó sẽ mở ra triển vọng cho việc sản xuất cây giống theo qui mô công nghiệp, đáp ứng đủ lượng cây trồng với chất lượng cao cho sản xuất trong nước và cho xuất khẩu.
Cây Lan giống sản xuất bằng hệ thống TIS trong nước giúp người nông dân chủ động sản xuất, hạn chế nhập cây giống từ nước ngoài, góp phần ngăn chặn được dịch bệnh lây lan từ nước ngoài qua con đường cây giống.
5. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nuôi cấy PLB trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời, nghiên cứu trên 5 giống Lan Hồ Điệp chủ yếu là giống 1 (Dtps. Taida Salu) và giống 2 (Dtps. Taida Firebird). Thí nghiệm bố trí kiểu đầy đủ và ngẫu nhiên hoàn toàn.