Luận Văn Nhân giống in vitro cây Giáng hương (Pterocarpus macrocapus)

Rừng nước ta đang bị mất dần nhiều loại thực vật có giá trị kinh tế cao. Trong
đó giáng hương là loài cây gỗ quý. Hiện nay do tình trạng phá rừng làm cho trữ lượng
của loài này bị giảm sút nặng và nằm trong danh sách các loài cần được bảo vệ.
Với các điều kiện đó và có lẽ cũng không còn là quá sớm đối với công cuộc
trồng rừng trong tương lai của đất nước, được sự chấp thuận của Bộ môn Công nghệ
sinh học và sự hướng dẫn tận tình của cô Trần Thị Dung chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nhân giống in vitro cây giáng hương (Pterocarpus macrocarpus)”.
1.2 Mục đích yêu cầu
1.2.1 Mục đích
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của hạt
giáng hương in vitro.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự nhân chồi và khả năng
tạo rễ của cây giáng hương in vitro.
1.2.2 Yêu cầu
- Xác định được nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp đối với hạt giáng
hương in vitro.
- Xác định nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật thích hợp đến khả năng
tạo chồi của cây giáng hương in vitro bằng phương pháp nuôi cấy chồi nách.
- Xác định nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật thích hợp cho sự tạo rễ
cây giáng hương in vitro trước khi đem ra vườn ươm.
1.3 Giới hạn đề tài
Do thời gian có hạn nên chưa thực hiện được thí nghiệm đưa cây con giáng
hương in vitro ra vườn ươm.
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu khái quát về cây giáng hương
Tên thường gọi: Cây Hương
Tên khoa học: Pterocarpus macrocarpus Kurz
Họ: Fabaceae
Họ phụ: Faboideae
Bộ:Fabales
2.1.1 Mô tả cây
Giáng hương là loại cây gỗ lớn, thuộc loại cây gỗ thân thẳng, tròn to có tán rộng,
có chiều cao khoảng từ 25 đến 40 mét, đường kính thân 0,9 mét hay lớn hơn, thay lá
vào mùa khô, gốc có bạnh vè, vỏ màu nâu sẫm, nứt dọc. Khi bị thương sẽ có nhựa đặc
màu đỏ tươi chảy ra. Cành non mảnh và có lông, cành già nhẵn. Lá kép lông chim lẻ
một lần, dài từ 15-25cm; mang 9-11 lá chét. Lá chét có hình bầu dục thuôn, gốc tròn,
đầu có mũi nhọn cứng. Hoa có màu vàng và có mùi thơm, làm thành chùm ở nách lá,
có cuống dài và nhiều lông màu nâu. Đài hình chuông cong ở gốc, có 5 răng ngắn, gần
bằng nhau hay không bằng nhau. Quả hình tròn dẹp, có mũi cong về hướng cuống,
màu vàng nâu, giữa quả có từ 1 đến 2 hạt, xung quanh có cánh mỏng và có lông mịn
nhung.
2.1.2 Sinh học
Là loài có lượng quả được sinh ra hàng năm rất nhiều, nhưng khả năng tái sinh
hạt rất kém có thể do lửa rừng. Tuy nhiên, về khả năng tái sinh chồi thì rất khoẻ mạnh.
Cây con được tạo từ hạt mang trồng sẽ phát triển nhanh trong thời gian rừng non, tăng
trường chiều cao mạnh nhất lúc 16-20 năm tuổi, đến giai đoạn trung niên sẽ chậm dần.
2.1.3 Phân bố
Giáng hương phân bổ chủ yếu trong rừng rậm nhiệt đới nửa rụng lá, mọc ở độ
cao dưới 700-800m, thường mọc hỗn giao với một số loài cây lá rộng khác. Chẵn hạn
như giáng hương thường mọc ở ranh giới với rừng rụng lá cây họ dầu
(Dierocapaceae), mọc hỗn giao với một số loài cây lá rộng khác như gỗ đỏ (Afzelia
xylocalpa), muồng đen (Cassia siamea), bằng lăng (Lagerstromia sp.), bình linh (Vitex
Hình 2.1:Cây giáng hương 14
sp.), ưa đất có thành phần đất thịt nhẹ đến trung bình, phong hóa từ các đá trầm tích
và macma acid, có khi cả trên đất đỏ bazan.
2.1.4 Đặc điểm gỗ và công dụng:
Gỗ đẹp, có mùi thơm, màu nâu hồng, mịn, có vân
đẹp do vòng năm khá rõ ràng, tia rất nhỏ, mật độ cao;
mạch to , tỷ trọng 0,84 – 0,90.
Thuộc nhóm gỗ quý hiếm, có mùi thơm, hoa vân
rất đẹp, được nhiều người ưa chuộng, dùng để làm đồ
gỗ cao cấp và mặt hàng mỹ nghệ, ít bị nứt nẻ và không bị mối mọt. Ngoài ra nhựa còn
có thể làm thuốc nhuộm màu đỏ.
2.1.5 Tình trạng:
Là loại cây rừng có giá trị kinh tế cao. Ở nước ta rất ít có diện tích rừng cây giáng
hương mọc tập trung ở độ tuổi thành thục, chủ yếu là mọc rải rác, đan xen với những
loài khác, hoặc tái sinh tự nhiên sau nương rẫy, do người dân bảo vệ, nuôi dưỡng trong
đất vườn rẫy, đang ở tuổi còn non hoặc tuổi trung niên. Cây có đường kính lớn thì rất
hiếm. Là loài cây quý hiếm của tỉnh đang bị người dân khai thác sử dụng không hợp
lý, làm giảm dần về số lượng vốn đã khan hiếm lại càng khan hiếm hơn. Mức độ đe
dọa: bậc V.

2.1.6 Giải pháp bảo vệ:
Giáng hương là đối tượng được bảo vệ của các khu rừng cấm Mom Rây, Ch.
Đôn,
Đề nghị Kiểm lâm địa bàn và Chính quyền địa phương quản lý chặt chẽ, bằng
cách không cấp giấy phép chặt hạ đối với những loại cây trung niên, chưa đến tuổi
thành thục, nhằm bảo vệ nguồn gen quý hiếm. Đồng thời, đề nghị trồng xen vào diện
tích trồng keo lá tràm và vận động cộng đồng trồng theo ranh đất.

2.2 Nhân giống cây trồng in vitro
2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy
mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có
Hình 2.2:Mẫu gỗ giáng hương
trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của
cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất.
Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý
hiếm.
Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực
vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu
cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp
nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu quá
trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White, 1939) và rễ (Nobercourt,
1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên
ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988). Qua kết quả nghiên
cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp:
Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy.
Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ của
các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình
thành chồi và rễ (Brown & Thorpe, 1986).
2.2.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực
vật. Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 – 20 năm trở lại đây.
Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát
triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn
Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định:
- Đó là tính toàn thế của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn
chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan trọng,
bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ
thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng.
- Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cây đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính
sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác
để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt). 16
- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với
tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây), cây cảnh
(phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch, .).
- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng
trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm.
- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra
các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo.
- Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen.
- Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả
năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống.
- Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây
hoàn chỉnh từ các protoplast lai.
- Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa.
- Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ
thấp không mất tính toàn thế của tế bào.
Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di
truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật.
Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng
không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế. Hai
nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới năm 2010 là: Tạo ra
các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là
công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế
bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995).
2.2.3 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm
sau:
Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phần này giống như nhân giống
vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn
trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như
cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt. 17
So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi
cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu
trong thời gian ngắn.
Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một
cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm nhiều
diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý
có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống được dễ
dàng.
2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Dương Công Kiên (2002), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật như sau:
2.2.4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Một trong những phương thức sinh trưởng để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy
tế bào và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và
chồi bên).
Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ
chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất
kích thích sinh trưởng thích hợp,
Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát
triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để
trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển
bình thường.
2.2.4.2 Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân
hoá của tế bào đã phân hoá. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện
của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi
trường không có chất kích thích tạo mô sẹo
2.2.4.3 Nuôi cấy tế bào đơn
Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có
tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn. Tế
bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối.
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách
ra và trải trên môi trường thạch. Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn
phát triển thành cụm tế bào mô sẹo. Khi trên môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin –
auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
2.2.4.4 Nuôi cấy protoplast - chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi
cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái
sinh thành cây hoàn chỉnh.
Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung
hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá
trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác
loài.
2.2.4.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội
Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành
mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.
2.2.5 Các giai đoạn nhân giống in vitro
Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ
đạt được khi trải qua các giai đoạn:
2.2.5.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in
vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào
nuôi cấy in vitro.
Theo tài liệu của Street (1974) các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô nuôi cấy
như sau:
Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý Hiệu quả
(phút)
Hypochlorit Calcium 9-10 5-30 Rất tốt
Natri hypochlorit 2 5-3 Rất tốt
Hydroperoxid 10-12 5-15 Tốt
Nước brom 1 -2 2 – 10 Rất tốt
HgCl2 0,1 -1 2 – 10 TB
Chất kháng sinh 4 – 50mg/l 30 – 60 Khá tốt
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy
vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử
chắc chắn sẽ đạt kết quả.
2.2.5.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi
cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin,
cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó
cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân hoá có
khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu. Người ta cũng còn
nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh
trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi.
2.2.5.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân,
ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng
(Auxin, Cytokynin, Gibberellin, ), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết
nấm men, kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng
đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các
cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm
cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
2.2.5.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất 20
hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi
trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ
phụ từ mô nuôi cấy.
2.2.5.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá
trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong
thực tiễn sản xuất.
Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng,
ẩm độ, giá thể, ) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như
ruộng sản xuất.
2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
2.2.6.1 Mẫu nuôi cấy
Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và
chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng cho
thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn lọc, tuổi
sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu.
- Kiểu gen
Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá được sử
dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các
genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi
nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt
phấn cà chua Lycopersycon esculentum Mill.
- Chọn cơ quan
Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử
dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau,
như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng
chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nẩy mầm từ hạt.
- Tuổi và sinh lý
Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho
thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều nghiên 21
cứu khác nhau vế ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi
nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già.
- Mẫu in vitro
Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có
khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như
ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al. (1991) ghi nhận nuôi
cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng.
- Sức sống của mẫu
Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in
vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những cây
sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối
với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn những cây
bệnh được nhân lên.
2.2.6.2 Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 27oC. Theo Murashige (1974), nhiệt
độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình
sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan.
Cường độ ánh sáng
Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến
khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng hình như có liên hệ
với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối
(Papachatzi et al., 1981; Miller và Murashige, 1976; Thorpe và Murashige, 1970).
Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điêu kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên,
2002).
Quang kỳ và chất lượng ánh sáng
+ Thời gian chiếu sáng
Ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng.
+ Chất lượng ánh sáng 22
Ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh
sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh
dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro.
+ Các chất khí
Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây in
vitro. O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều trong môi
trường nuôi cấy. Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến quá trình làm khô
mẫu nuôi cấy.
2.2.6.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết. Vì
mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau. Mặt
khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ theo trường
hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh.
Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy
hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp cho
mẫu nuôi cấy.
Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính với nguyên tắc
có sự cân bằng các yếu tố trong môi trường.
Các thành phần chính:
- Đường làm nguồn carbon.
- Các muối khoáng đa lượng.
- Các vitamin.
- Các chất sinh trưởng.
Ngoài ra các tác giả còn cho thêm một số chất hữu cơ như: Nước dừa, nước
chiết nấm men.
2.2.7 Những vấn đề trong nhân giống in vitro
2.2.7.1 Tính bất định về mặt di truyền
Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính đã được sử dụng nhằm mục đích tạo ra
quần thể cây trồng đồng nhất (true-to-type) với số lượng lớn, nhưng cũng tạo ra những
biến dị soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn. Những biến dị này được
nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng (Evans và Sharp,1986, 1988;
Larkin, 1987). Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Sreissen và
Karp, 1985; Fish và Karp, 1986).
Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma như:
- Kiểu di truyền
- Thể bội
- Số lần cấy chuyền
- Loại mô
2.2.7.2 Sự hoại mẫu
Có hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro:
- Bị vi sinh vật huỷ hoại, có thể khử trùng mẫu trước khi đưa vào môi trường.
- Bị virus hay thể giống như virus xâm nhiễm, không hại mẫu nhưng có ảnh
hưởng về sau.
Tuy nhiên có sự xâm nhiễm của vi sinh vật như Agrobacterrium, Bacillus và
Pseudomanas vào nhu mô dẫn truyền sẽ hoại mẫu khi tế bào bắt đầu phân chia.
Có thể làm giảm khả năng hoại mẫu bằng cách:
- Khử trùng mẫu trước khi cấy vào môi trường.
- Sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh.
2.2.7.3 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấy
Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hoá nâu hay hoá đen mẫu, sinh trưởng
của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều
chất tannin hay hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn mô non.
Khi môi trường và mô cấy bị đổi màu quá mức thì absorbent được sử dụng. Hai
loại absorbent thông thường là polyvinylpyrrolidone (PVP) và than hoạt tính. Nhưng
một số nghiên cứu cho rằng nên sử dụng than hoạt tính (Mohamed – Yassen et al.,
1995 và Wann et al., 1997)
Nhiều phương pháp làm giảm sự hoá nâu được đề nghị và được nhiều nhà khoa
học đồng ý như:
Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non.
Gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng.
Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid và citric acid vài giờ trước khi cấy.
Nuôi cấy trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần.
Chuyển mẩu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng thấp qua môi trường
có nồng độ cao hơn.
2.2.7.4 Sử dụng thuốc kháng sinh
Có nhiều loại thuốc kháng sinh sử dụng trong nuôi cấy mô, nhằm hạn chế sự
hoại mẫu của vi sinh vật như kanamycin, penicillin, nystatin, amphotericin B, Nồng
độ sử dụng 5 -100 g/l phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy như tế bào hay tế bào trần. Sự
huỷ hoại của chất kháng sinh lên mô thực vật xảy ra ở plastid hay mitochondria, xử lý
càng lâu hay nồng độ càng cao dễ dàng dẫn đến sự thay đổi kiểu gen của tế bào chất
hay DNA.
2.2.7.5 Hiện tượng thuỷ tinh thể
Thân lá phồng to chứa nhiều nước, cây có dạng trong. Đây là một dạng bệnh lý
thường thấy khi cây được nuôi trong môi trường mà việc trao đổi khí giữa cây và môi
trường bên ngoài bị dừng lại, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây.
Một số phương pháp hạn chế quá trình hoá thuỷ tinh thể:
Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường trong
môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao.
Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy và tiếp xúc với mẫu cấy ít nhất.
Ở một số loài có thể sử dụng chất ABA.
Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy.
Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng
và giảm nhiệt độ phòng cấy.
2.2.8 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)
Chất ĐHSTTV hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản
phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo). Chúng có tác dụng
điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Tuy nhiên, các chất
ĐHSTTV chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào
quá trình trao đổi chất. Nó không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng. Chất
ĐHSTTV gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé lên trao đổi chất của tế 25
bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm. Trong thành phần môi
trường nuôi cấy, các chất ĐHSTTV làm việc như chiếc chìa khoá đóng mở sự hoạt
động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt chất. Tác dụng của
chất ĐHSTTV liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng tổng hợp enzyme trong
cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử DNA. Mỗi một chất ĐHSTTV đều
mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của thực vật, để điều khiển những hoạt
động của thực vật, chúng tham gia vào thường không phải là một mà là vài chất. Tuỳ
mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có
khác nhau. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chúng tôi sử dụng các chất thuộc
nhóm auxin và cytokinin.
2.2.8.1 Auxin
Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự
hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả.
Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự
phân giải chúng. Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai
trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hoá tế bào cần thiết cho sự
phát triển bình thường của thực vật. Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm
bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:
- Indol acetic acid (IAA)
- Naphthyl acetic acid (NAA).
- 2,4-D Dichlorophenol acetic acid (2,4-D).
- Indol butyric acid (IBA).
2.2.8.2 Cytokinin
Bao gồm các nhóm chất:
- 6-Benzylaaminopurin (BAP).
- Kinetin (Ki).
- Zeatin (Z).
- Thidiazuron (TDZ).
Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng
tốc độ phân bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời
ức chế sự phân hoá rễ của mô cấy. 26
Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này
cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong một tỷ
lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường
cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi. Và ngược lại, auxin cao hơn cytokinin
thì kích thích sự tạo rễ.
Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp
DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất.
2.2.9 Những thành tựu về nuôi cấy mô cây rừng trên thế giới và Việt Nam
2.2.9.1 Trên thế giới
Ngành nuôi cấy mô đã thu được nhiều thành tựu ở các lĩnh vực cây trồng công
nghiệp (cà phê, thuốc lá, cọ dầu, cao su, ), cây nông nghiệp, thực phẩm (khoai tây,
lúa, bắp cải, ), cây cảnh (phong lan, cẩm chướng, huệ, ) (Albert Sassons, 1988;
Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993; Bezborogov và các tác giả, 1994). Đặc biệt
trên lĩnh vực cây cảnh thì phong lan nuôi cấy mô được phát triển rất rộng rãi cả trong
nước và ngoài nước (Nguyễn Thiện Tịch và các tác giả, 1988; Võ Thị Bạch Mai,
1996). Cây ăn trái lâu năm: cây khế, mãng cầu xiêm, măng cụt, (Nguyễn Văn Uyển
và các tác giả, 1993). Trong tạp chí “Plant physiology” (1988) và nhiều tài liệu khác,
các nhà khoa học Nga cũng cho biết kết quả nuôi cấy mô nhiều loài cây khác nhau như
thông, bạch dương,
Ngày nay cây trồng từ cấy mô không chỉ quen thuộc với các nhà nghiên cứu,
các nhà kinh doanh, sản xuất chuyên nghiệp mà cả những người nông dân, người làm
vườn thủ công cũng đã biết và quan tâm tới như cây khoai tây, cây chuối,
Tuy nhiên trên lĩnh vực cây trồng rừng, nhất là những cây quý, hiếm, lâu năm
do những đặc thù riêng còn ít được nghiên cứu kể cả về chủng loài và quy mô nghiên
cứu. Các kết quả đã có đều chủ yếu nghiên cứu cho các loài cây mọc nhanh, cây có giá
trị kinh tế trong thời hạn kinh doanh ngắn, có khả năng mau chóng đáp ứng nhu cầu
phủ xanh đất trồng và cung cấp được khối lượng nguyên liệu đáng kể cho nền kinh tế
và đời sống người dân (nhựa mủ, gỗ, củi, ).
Reilly và Washev (1977) đã tách chồi mầm cây thông (Pinus sp.) được tách từ
hạt gieo trong ống nghiệm. Từ những năm 1970 người ta đã nuôi cấy thành công mảnh
lá, cuống lá, đoạn thân, rễ bạch đàn (Albert Sassons, 1988). Các nhà nghiên cứu Mỹ đã 27
tạo được cây con từ nuôi cấy đoạn thân loài Eucalyptus grandis, E. gunni, E.
danrympleama , vào các năm 1977, 1979.
Năm 1973, Afocel đã khởi sự nghiên cứu nhân giống vô tính cây bạch đàn
nhằm mục đích sản xuất lớn các dòng vô tính chịu lạnh, năng suất gỗ cao. Người ta đã
tạo cây từ hạt nảy mầm trong ống nghiệm, hoặc cắt các chồi non từ các cây chọn lọc,
từ cành ghép. Từ năm 1975, cây cấy mô được bắt đầu trồng ra ngoài đất với số lượng
20.000 cây / tháng.
Một số giống bạch đàn có năng suất cao, hay giá trị kinh tế về tinh dầu cũng
được thử nghiệm ở nhiều nước nhiệt đới: Ấn Độ, Senegal, hàng năm từ một đoạn cành
có thể cho 50.000 cây con hay hơn nữa (Albert Sassons, 1988).
Tại hội nghị Kaset Sart (Thái Lan, 1994) cũng đã báo cáo kết quả nhân giống
thành công 55 loài tre trúc và dự định phục vụ dự án trồng rừng của Thái Lan, với sản
lượng 1 triệu cây con / năm (Pranon Prutgongse, 1994).
Ở Malaysia cũng đã có kết quả vi nhân giống các loài cây gỗ như Acacia
mangium; Gmelia arborea (Marziah Mahmood, 1995).
2.2.9.2 Tại Việt Nam
Nước ta có một số cơ sở giống cây rừng, Viện lâm nghiệp, nhiều Trường Đại
học Nông Nghiệp và khoa học (sinh học) cũng đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô.
Điển hình là Xí nghiệp giống và phục vụ trồng rừng TP.HCM đã được chuyển giao
một Trung tâm nuôi cấy mô lớn từ Quảng Đông (Trung Quốc). Hiện nay Trung tâm có
khả năng cung cấp 1 triệu cây con / năm với khoảng 10 dòng bạch đàn và các loại
tếch, keo lá tràm (báo cáo tại hội nghị CNSH lần III, 1995).
Trung tâm nghiên cứu lâm nghiệp Phù Ninh-Vĩnh Phú cũng xây dựng phòng
nuôi cấy mô 1994, đến tháng 5 năm 1995 đã sản xuất 50000 cây con bạch đàn, và
trồng thử ở một số tỉnh Vĩnh Phú, Quảng Ninh, Gia Lai (Mai Đình Hồng, 1995). Cũng
như kết quả thông báo nuôi cấy mô bạch đàn lại thành công và trồng ra ngoài đất tự
nhiên của Nguyễn Ngọc Tân (1995).
Khoa lâm nghiệp trường Đại học Nông Lâm TP. HCM, cũng đã có nhiều thành
tựu về nuôi cấy mô cây rừng như: nuôi cấy mô một loài cây bạch đàn (E.
camaldulensis), cây thông caribê (Pinus caribaea), cây giá tỵ (Tectona grandis Linn
F.), cây thông ba lá (Pinus kharya Royle), cây thông đỏ, cây trầm hương, cây mây
nếp, . song kết quả còn chủ yếu dừng lại ở giai đoạn ống nghiệm.
Qua các kết quả còn rất hạn hẹp như vậy, chứng tỏ những năm qua nhu cầu thị
trường cây cấy mô cho trồng rừng trong nước chưa cao nhất là đối với các loài cây gỗ
quý, hiếm, lâu năm. Mặc dù vậy những thành tựu đã có cũng là những cơ sở, kinh
nghiệm và hy vọng để đặt vấn đề nuôi cấy cây giáng hương, là một loài cây quý của
rừng nhiệt đới đang có nguy cơ bị tiêu diệt.
Hy vọng không chỉ đặt vào khả năng thành công từ các thí nghiệm mà cả triển
vọng ứng dụng trong thực tế trồng rừng ở nước ta. Vì ngoài những thành tựu không
nhỏ nêu trên, còn phải nói đến một thành công rất lớn trong định hướng phát triển
ngành nuôi cấy mô cây rừng của nhà nước và các nhà chuyên môn lâm nghiệp. Đó là
sự đầu tư thích đáng để chuyển giao những công nghệ hện đại từ Trung Quốc, đặc biệt
là ở Xí nghiệp giống và phục vụ trồng rừng TP.HCM được đánh giá là trung tâm nuôi
cấy mô lớn và hiện đại nhất trong nước hiện nay. Trên thực tế xí nghiệp đã triển khai
hiệu quả, đã trồng thử và cung cấp giống cây mô cho một số cơ sở trồng rừng. Kết quả
cây con (bạch đàn) sau một năm có thể đạt chiều cao 6-7 m, đường kính gốc đạt 10cm.
Chỉ sau 3 tháng một số giống bạch đàn đo được đường kính gốc bình quân 3,8 cm.
Chiều cao vút ngọn 2,5-2,8 m (đo tháng 10.1996).
Trong thời gian tới, các trung tâm và cơ sở nuôi cấy mô khác sẽ còn đưa ra
nhiều thành công nuôi cấy cây rừng với nhiều chủng loại hơn, phục vụ được các kế
hoạch trồng rừng của nước ta. “Kế hoạch CNSH năm 1996 – 2010 trong đó quan tâm
nhân nhanh các cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây thuốc quý” (Nguyễn Văn Uyển, 1995).
Hiện nay vấn đề khẩn thiết và cần quan tâm hơn nữa tới tiềm năng của việc phổ
biến ứng dụng vi nhân giống đối với các loài cây gỗ. Ảnh hưởng kinh tế của ứng dụng
nhân giống vô tính các loài thực vật này là rất lớn đối với những vùng nhiệt đới và á
nhiệt đới (Gamborg, 1995)

geslink.com

MỤC LỤC
CHưƠNG TRANG
Lời cảm tạ i
Tóm tắt . ii
Mục lục . iii
Danh sách các bảng vi
Danh sách các hình . vii
Danh sách các chữ viết tắt viii
1. MỞ ĐẦU . 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích yêu cầu . 2
1.2.1 Mục đích . 2
1.2.2 Yêu cầu . 2
1.3 Giới hạn đề tài 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu về cây giáng hương 3
2.1.1 Mô tả cây . 3
2.1.2 Sinh học . . 3
2.1.3 Phân bố . 3
2.1.4 Đặc điểm gỗ và công dụng . 4
2.1.5 Tình trạng . . 4
2.1.6 Giải pháp bảo vệ . 4
2.2 Nhân giống cây trồng in vitro . . 4
2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật . . 4
2.2.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật . . 5
2.2.3 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật . 6
2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật . 7
2.2.4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng . 7
2.2.4.2 Nuôi cấy mô sẹo . . 7 6
2.2.4.3 Nuôi cấy tế bào đơn . 8
2.2.4.4 Nuôi cấy protoplast - chuyển gen . . 8
2.2.4.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội . . 8
2.2.5 Các giai đoạn nhân giống in vitro . 8
2.2.5.1 Giai đoạn 1 . . 8
2.2.5.2 Giai đoạn 2 . . 9
2.2.5.3 Giai đoạn 3 . . 9
2.2.5.4 Giai đoạn 4 . . 9
2.2.5.5 Giai đoạn 5 . . 10
2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro . 10
2.2.6.1 Mẫu nuôi cấy . 10
2.2.6.2 Điều kiện nuôi cấy . 11
2.2.6.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy . 12
2.2.7 Những vấn đề trong nhân giống in vitro . 12
2.2.7.1 Tính bất định về mặt di truyền . . 12
2.2.7.2 Sự hoại mẫu . 13
2.2.7.3 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấy . 13
2.2.7.4 Sử dụng thuốc kháng sinh . 14
2.2.7.5 Hiện tượng thủy tinh thể . . 14
2.2.8 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật . 14
2.2.8.1 Auxin . 15
2.2.8.2 Cytokynin . . 15
2.2.9 Những thành tựu về nuôi cấy mô cây rừng . 16
2.2.9.1 Trên thế giới . . 16
2.2.9.2 Tại Việt Nam . 17
3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . . 19
3.1 Đối tượng thí nghiệm . 19
3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . . 19
3.3 Vật liệu nghiên cứu . . 19
3.3.1 Trang thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu . 19
3.3.2 Môi trường nuôi cấy . 19
3.4 Điều kiện nuôi cấy in vitro . 21 7
3.5 Phương pháp khử trùng . . 21
3.5.1 Vật liệu . . 21
3.5.2 Phương pháp khử trùng mẫu . 21
3.5.3 Cấy mẫu . . 21
3.6 Phương pháp thí nghiệm . . 22
3.6.1 Thí nghiệm 1 . 22
3.6.2 Thí nghiệm 2 . 22
3.6.2.1 Thí nghiệm 2a . . 22
3.6.2 2 Thí nghiệm 2b . . 23
3.6.3 Thí nghiệm 3 . 24
3.6.4 Phân tích thống kê . 25
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . . 26
4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của
mẫu cấy cây giáng hương in vitro. . 26
4.2 Thí nghiệm 2 . . 27
4.2.1 Thí nghiệm 2a: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA lên khả năng tạo chồi
của cây giáng hương in vitro . . 28
4.2.2 Thí nghiệm 2b: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng
tạo chồi của cây giáng hương in vitro 30
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của IBA và NAA đến sự hình thành rễ của
cây giáng hương in vitro . 31
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . . 33
5.1 Kết luận . . 33
5.2 Đề nghị . 33
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . . 34
PHỤ LỤC . 35
PHỤ LỤC 1 . . 36
PHỤ LỤC 2 . . 38