Luận Văn Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối Conus bằng kỹ thuật PCR

Đồ án tốt nghiệp
Đề tài: Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối Conus bằng kỹ thuật PCR


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH . iv
LỜI NÓI ĐẦU . 1
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Khái quát về ốc cối . 4
1.1.1. Phân loại . 4
1.1.2. Đặc điểm chung 4
1.2. Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại các
động vật thân mềm .12
1.2.1. Chỉ thị ty thể 12
1.2.2. Chỉ thị nhân .13
1.3. Tình hình nghiên cứu phân loại ốc cối 14
1.3.1. Trên thế giới .14
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .18
Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Nguyên vật liệu 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .20
2.1.2. Hoá chất .20
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu .22
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 22
2.2.2. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24
2.2.3. Điện di gel agarose .27
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Tách chiết DNA tổng số ốc cối .29
3.2. Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các mẫu ốc cối bằng kỹ thuật
PCR 32
iii
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .40
iv
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
Danh mục bảng:
Bảng 1.1: Các siêu họ gen mã hóa peptide độc tố ốc Conus . 12
Bảng 1.2: Các peptide độc tố được thử nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng . 13
Bảng 3.1: Danh sách các loài ốc cối Conus đã tách chiết được DNA 32
Bảng 3.2: Các thông số của mồi 33
Bảng 3.3: Danh sách các loài ốc cối đã nhân gen . 36
Bảng 3.4: Danh sách các loài ốc cối đã giải trình tự đoạn gen 16S rDNA 36
Danh mục hình:
Hình 1.1: Ảnh minh họa các loài ốc cối Conus 09
Hình 1.2: Bản đồ địa lý về sự phân bố ốc cối Conus tại các vùng biển Việt Nam . 10
Hình 1.3: Cấu trúc tổng quát đoạn chèn ITS2 . 16
Hình 1.4: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 19
Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR . 26
Hình 3.1: Ảnh minh họa vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA . 30
Hình 3.2: Ảnh điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối . 32
Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các mẫu ốc cối . 35
1
LỜI NÓI ĐẦU
Loài ốc cối Conus sống tại vùng biển nhiệt đới vốn nổi tiếng là nguồn
nguyên liệu sản xuất "thần dược" chữa các cơn đau mạn tính, ung thư và nhiều
bệnh khác. Các nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy độc tố ốc cối
(conotoxin) có hiệu quả giảm đau cao gấp 10.000 lần so với morphine mà không
gây nghiện hoặc các phản ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất cả các loại thuốc
giảm đau hiện nay. Vì vậy, trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 cuộc nghiên
cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng
của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào.
Tuy nhiên cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới chiết xuất và phân tích
được khoảng 100 độc tố từ nguồn tiềm năng chứa tới 70.000 độc tố của ốc cối.
Do vậy, các nghiên cứu sâu hơn về ốc cối và độc tố ốc cối vẫn đang và sẽ được
tiếp tục tiến hành trong đó có các nghiên cứu phát sinh chủng loại ốc cối.
Hơn thế nữa, các loài ốc cối có quan hệ di truyền gần nhau thường chứa
các peptide độc tố giống nhau hơn là các loài có mối quan hệ xa nhau. Do vậy,
các nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối không chỉ làm cơ sở cho việc
phát hiện các loài ốc cối mới, mà còn góp phần quan trọng vào quá trình nghiên
cứu các conotoxin mới, nhằm phát huy hết tiềm năng vốn có của chúng.
Bên cạnh giá trị đối với y học, các loài ốc cối còn có giá trị kinh tế cao. Do
có màu sắc và hoa văn đẹp, vỏ của các loài ốc cối thường được khai thác để làm
đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩ m lưu niệm. Tình trạng khai thác một cách
bừa bãi các loài ốc cối đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn
một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài nguyên này.
2
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự đa dạng
loài của ốc cối. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ dừng
lại ở mức độ thống kê các loài đặc hữu và mô tả các đặc điểm hình thái giải
phẫu. Hiện chưa có một nghiên cứu nào về ốc cối ở mức độ phân tử. Vì vậy,
nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp
sinh học phân tử là điều rất cần thiết.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nhân đoạn gen mã hóa
16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối Conus bằng kỹ thuật PCR”,
làm cơ sở cho việc xây dựng cây phát sinh chủng loại và tìm kiếm các loài ốc cối
mới ở Việt Nam.
Đề tài này nhằm các mục tiêu chính sau đây:
 Tách chiết DNA tổng số của các loài ốc cối Việt Nam thu thập tại hai
khu vực: Đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi và Cù Lao Chàm, Quảng Nam.
 Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối
bằng kỹ thuật PCR, làm cơ sở cho việc giải trình tự gen nhằm xác định
loài và xây dựng cây phát sinh chủng loại.
Sự thành công của đề tài này sẽ góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn
và khai thác hợp lý nguồn gen các loài ốc cối Việt Nam.
3
Chương I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1. Khái quát về ốc cối
1.1.1. Phân loại
Họ ốc cối Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một trong
những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mề m. Cho đến nay,
trên thế giới người ta đã xác định được khoảng 700 loài, trong đó chủ yếu thuộc
chi Conus.
Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758)
Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795)
Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997)
Liên họ: Conoidea (Fleming, 1822)
Họ: Conidae (Rafinesque, 1815)
Chi: Conus (Linnaeus, 1758)
(http://zipcodezoo.com/Key/Animalia/Conus_Genus.asp)
1.1.2. Đặc điểm chung
Ốc cối có vỏ dạng hình thoi, tháp vỏ thấp, tầng thân lớn, miệng vỏ hẹp dài,
trục vỏ thẳng, không có nếp uốn vặn, với màu sắc sặc sỡ, hoa văn đa dạng, mép
trong và mép ngoài miệng vỏ đơn giản, nắp vỏ bằng chất sừng, da vỏ có vân
màu, kích thước rất khác nhau tùy theo loài (loài lớn nhất có thể dài đến 23 cm)
(Ngô Anh Tuấn, 2009) (Hình 1.1). Chúng phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt
đới và vùng biển ấm như Philíppin, Indonesia, Australia, Mexico, Florida,
Hawaii Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một số loài có thể thích ứng
với sự thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam
Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ. Hầu hết các loài ốc Conus
nhiệt đới sống trong hoặc gần các rạn san hô, trong khi các loài cận nhiệt đới
5
được tìm thấy chủ yếu tại vùng dưới triều ở độ sâu từ 10-30m và dưới các tảng
đá ở vùng triều nông (Stewart và Gilly, 2005).
Hình 1.1: Ảnh minh họa các loài ốc cối Conus
(http://www.conidae.info)
Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực
Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (như Trường


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Azam L, Dowell C, Watkins M, Stitzel JA, Olivera BM, McIntosh JM.
Alpha-conotoxin BuIA, a novel peptide from Conus bullatus, distinguishes
among neuronal nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem (2005) 280:
80-87.
2. Ainzilber M, Kofman O, Zlotkin E, Gordon D. A new neurotoxin receptor
site on sodium channels is identified by a conotoxin that affects sodium
channel inactivation in molluscs and acts as an antagonist in rat brain. J Biol
Chem (1994) 269: 2574-2580.
3. Bandyopadhyay PK, Stevenson BJ, Cady MT, Olivera BM, Wolstenholme
DR. Complete mitochondrial DNA sequence of a Conoidean gastropod,
Lophiotoma (Xenuroturris) cerithiformis: gene order and gastropod
phylogeny. Toxicon (2006) 48:29-43.
4. Bandyopadhyay PK, Stevenson BJ, Ownby JP, Cady MT, Watkins M,
Olivera BM. The mitochondrial genome of Conus textile, coxI-coxII
intergenic sequences and Conoidean evolution. Mol Phylogenet Evol (2008)
46:215-223.
5. Becker S, Terlau H. Toxins from cone snails: properties, applications and
biotechnological production. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 79: 1-9.
6. Chivian E, Roberts CM, Bernstein AS. The threat to cone snails. Science
(2003) 302: 391.
7. Duda TF, Kohn AJ, Palumbi Sr. origins of diverse feeding ecologies within
Conus, a genus of venomous marine gastropods. Biological Journal of the
Linnean Society (2001), 73: 391–409.
8. Duda TF, Jr., Rolan E. Explosive radiation of Cape Verde Conus, a marine
species flock. Mol Ecol (2005) 14:267-272.
41
9. Duda TF, Jr., Bolin MB, Meyer CP, Kohn AJ. Hidden diversity in a
hyperdiverse gastropod genus: discovery of previously unidentified members
of a Conus species complex. Mol Phylogenet Evol (2008) 49:867-876.
10. Espiritu DJ, Watkins M, Dia-Monje V, Cartier GE, Cruz LJ, Olivera BM.
Venomous cone snails: molecular phylogeny and the generation of toxin
diversity. Toxicon (2001) 39:1899-1916.
11. Epstein PR, Chivian E, Frith K. Emerging diseases threaten conservation.
Environ Health Perspect (2003) 111: A506-507.
12. Grande C, Templado J, Zardoya R. Evolution of gastropod mitochondrial
genome arrangements. BMC Evol Biol (2008) 8:61.
13. Hillyard DR, Olivera BM, Woodward S, Corpuz GP, Gray WR, Ramilo CA,
et al. A molluscivorous Conus toxin: conserved frameworks in conotoxins.
Biochemistry (1989) 28: 358-361.
14. Hillyard DR, et al. A new Conus peptide ligand for mammalian presynaptic
Ca2+ channels. Neuron (1992) 9:69-77.
15. Terlau H, Olivera BM. Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides. Physiol Rev (2004) 84:41-68.
16. Stewart J, Gilly WF. Piscivorous behavior of a temperate cone snail, Conus
californicus. Biol Bull (2005) 209:146-153.
17. Kaas Q, Westermann JC, Halai R, Wang CK, Craik DJ. ConoServer, a
database for conopeptide sequences and structures. Bioinformatics (2008) 24:
445-446.
18. Marshall J, Kelley WP, Rubakhin SS, Bingham JP, Sweedler JV, Gilly WF.
Anatomical correlates of venom production in Conus californicus. Biol Bull
(2002) 203: 27-41.
42
19. Nam HH, Corneli PS, Watkins M, Olivera B, Bandyopadhyay P. Multiple
genes elucidate the evolution of venomous snail-hunting Conus species. Mol
Phylogenet Evol (2009) 53:645-652.
20. Nguyễn Ngọc Thạch. Recently collected shells of Viet Nam.L’ Informatore
piceno & N.N.T (2007): 7-8 & 24-142.
21. Nguyễn Anh Tuấn. Kết quả khảo sát và thu mẫu ốc cối tại 4 tỉnh Nam Trung
Bộ (2009).
22. Olivera BM, et al. Neuronal calcium channel antagonists. Discrimination
between calcium channel subtypes using omega-conotoxin from Conus
magus venom. Biochemistry (1987) 26:2086-2090.
23. Olivera BM. Conus peptides: biodiversity-based discovery and exogenomics.
J Biol Chem (2006) 281: 31173-31177.
24. Ramilo CA, Zafaralla GC, Nadasdi L, Hammerland LG, Yoshikami D, Gray
WR, et al. Novel alpha- and omega-conotoxins from Conus striatus venom.
Biochemistry (1992) 31: 9919-9926.
25. Wang CZ, Chi CW Conus peptides--a rich pharmaceutical treasure. Acta
Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2004) 36: 713-723.
26. http://www.conidae.info/
27. http://biology.burke.washington.edu/conus/
28. http://www.ZipcodeZoo.com