Thạc Sĩ Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử d

TÓM TẮT LUẬN ÁN
1. Tóm tắt mở đầu:
Tên tác giả: Lê Thị Hường Hoa
Tên luận án:
“ Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm”
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất. Mã số: 62 72 04 10
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Dược Hà Nội
2. Nội dung bản tóm tắt
2.1. Mục tiêu của luận án:
1- Thẩm định chuyển giao các phương pháp phân tích hòa hợp của ASEAN trong quản lý mỹ phẩm
2- Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích xác định một số chất bị cấm trong mỹ phẩm.
3- Kiểm tra, phát hiện các chất bị cấm và chất có giới hạn hàm lượng sử dụng đã được nghiên cứu trong một số dạng mẫu mỹ phẩm trên thị trường.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp HPLC
2.2.1.1. Khảo sát, lựa chọn qui trình phân tích: Khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu: chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bền trong môi trường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm nền mẫu, phương pháp phân tích).
Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp: cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detector PDA, thể tích tiêm mẫu. Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết pic và chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ số tương đương của píc nghi ngờ thu được từ mẫu thử với pic thu được từ mẫu chuẩn. Định lượng bằng cách so sánh diện tích hoặc chiều cao píc thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn.
2.2.1.2. Đánh giá phương pháp phân tích: Với đối tượng nghiên cứu là các chất cấm nên trong thẩm định đánh giá phương pháp phân tích coi như phép thẩm định đánh giá các tạp chất (thường có nồng độ nhỏ trong mẫu). Tham khảo dự thảo hướng dẫn của ASEAN về đánh giá phương pháp phân tích mỹ phẩm, hướng dẫn của ICH, Dược điển Mỹ (USP 34), Dược điển Anh BP 2010, thông tư 22/TT-BYT, tài liệu đào tạo của VKNTTW và của các chuyên gia, qui định về các chỉ số cần đánh giá:
v Với qui trình phân tích định tính: đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện.
v Với qui trình phân tích xác định giới hạn tạp (Hg, Pb, As): độ thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (theo ICH), USP yêu cầu thêm: độ đúng và khoảng xác định.
v Với qui trình phân tích định lượng: độ phù hợp của hệ thống sắc ký, tính đặc hiệu, độ chính xác, khoảng tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ít nhất đạt được yêu cầu như các qui trình ASEAN đã đưa ra.
- Tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với các dung dịch chuẩn, tự tạo hay mẫu thử (ít nhất 6 lần tiêm). Yêu cầu: Độ phân giải giữa pic liền kề với píc của chất cần phân tích phải ≥ 1,5. Số đĩa lý thuyết ≥ 2000. Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích píc phải ≤ 2,0% . Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp. Các thông số khác của píc phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp HPLC.
- Độ đặc hiệu: Tiến hành sắc ký các loại mẫu: mẫu trắng (dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu); mẫu nền (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích); mẫu chuẩn; mẫu tự tạo (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình.
Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo: píc của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các píc khác (nếu có trong nền mẫu), píc của chất cần phân tích có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng píc phải ≤ 1,0% so với đáp ứng píc của mẫu chuẩn. Píc của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết. Hệ số chồng phổ UV-VIS của píc hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc ký đồ của dung dịch thử/tự tạo với píc tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn ≥ 0,99.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (5 dung dịch). Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng píc thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R[SUP]2[/SUP] ≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp. Hệ số y-intercept tại nồng độ 100% (Y): Y ≤ 5,0% cho Hydroquinon (kem chứa Hydroquinon có hàm lượng tối đa cho phép ≤ 2%); Y ≤ 10% cho các chất màu cấm, Tretinoin hay các nguyên tố độc với: Y = (Hệ số chắn x 100)/ S[SUB]pic[/SUB] (hay độ hấp thụ) ở nồng độ 100%.
- Độ đúng: Xác định trên các mẫu tự tạo. Cách 1: Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu không có chất cần phân tích. Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ phân tích. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính. Cách 2: chuẩn bị và phân tích 6 mẫu thử độc lập với lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với mức nồng độ 100% của qui trình phân tích. Tính lượng thu hồi theo công thức: Tỷ lệ thu hồi (%) = (Lượng chất phân tích tìm lại x 100)/ Lượng chất chuẩn thêm vào.
Tham khảo hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phép thử định lượng: Tỷ lệ thu hồi 98,0-102,0% cho qui trình phân tích định lượng Hydroquinon và RSD của tỷ lệ thu hồi ≤ 2,0% ở mỗi mức nồng độ . Tỷ lệ thu hồi (80,0 – 110,0%) cho qui trình phân tích các chất màu cấm, Tretinoin và Hg (nồng độ chất phân tích nhỏ 100 ppb - 10 ppm).
- Khoảng xác định: Được suy ra từ kết quả độ đúng (từ giá trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng).
- Độ chính xác: Độ lặp lại: định lượng 06 mẫu thử độc lập trong cùng ngày. Độ chính xác trung gian: tiến hành như độ lặp lại nhưng khác ngày/khác kiểm nghiệm viên/khác hệ thống HPLC. Tham khảo hướng dẫn của AOAC, giới hạn chấp nhận phù hợp cho mẫu phân tích ở nồng độ nhỏ (100 ppm): Giá trị RSD kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên/mỗi ngày (n=6) ≤ 3,0% và của cả hai kiểm nghiệm viên/khác ngày (n=12) phải ≤ 5,0%.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Có thể tiến hành theo cách pha loãng hoặc dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng. Giá trị LOD = (3,3 x δ)/a, trong đó: δ: Độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu nền (placebo), a: Hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính (y = ax +b) giữa nồng độ và đáp ứng píc của chất cần phân tích. LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt)
2.2.2. Phương pháp AAS: Áp dụng định lượng thủy ngân (và các kim loại độc) trong kem và phấn bôi da mỹ phẩm.
2.2.2.1. Thiết lập qui trình phân tích thủy ngân: Qui trình phải phù hợp với thiết bị hóa hơi lạnh sẵn có, phương pháp đo toàn lượng gián đoạn (khác với ASEAN thiết bị đo dòng liên tục) trong mỹ phẩm dạng kem bôi da và phấn trang điểm (phấn má, phấn mắt). Nghiên cứu thiết lập điều kiện cụ thể cho 2 giai đoạn chính của phương pháp phân tích thủy ngân: Khảo sát, lựa chọn qui trình xử lý mẫu (tác nhân vô cơ hóa, lượng mẫu đem phân tích, lượng tác nhân sử dụng). Xác định các thông số làm việc của máy quang phổ (vạch phổ đo, cường độ dòng làm việc của đèn cathod rỗng, độ rộng khe (slit width), thời gian lấy tín hiệu, chế độ đo .). Thông số hoạt động của bộ phân tích thủy ngân (nhất là tốc độ quay của bơm nhu động). Thao tác đo.
2.2.2.2. Đánh giá qui trình phân tích: Các chỉ tiêu cần đánh giá: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, khoảng xác định, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (tương tự như phương pháp HPLC). Yêu cầu: Độ tuyến tính: r ≥ 0,997, y-intercept ≤ 5%; Độ chính xác: RSD ≤ 10% (n=6), RSD ≤ 11(n=12); Độ đúng: đánh giá qua tỷ lệ thu hồi: 80,0 – 110,0% cho qui trình phân tích Hg; 60,0-115,0%, RSD ≤ 15% cho qui trình phân tích Pb, Cd, As bằng phương pháp AAS với kỹ thuật lò và kỹ thuật hydrid (nồng độ phân tích 10[SUP]-8[/SUP]). Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp.
2.2.3. Thẩm định chuyển giao các phương pháp, tính khả thi của qui trình ASEAN trong điều kiện Việt Nam: Thẩm định tính khả thi, chuyển giao phương pháp và biên soạn lại qui trình phân tích Tretinoin, chì, arsen theo qui trình ASEAN đã đưa ra gồm: Thẩm định độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ chính xác, khoảng tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng theo yêu cầu như các qui trình ASEAN đã đưa ra.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu phân tích: Các kết quả thực nghiệm được xử lý và tính các giá trị thống kê trên Microsoft Excell để rút ra nhận xét kết luận.
2. 3. Kết quả chính và kết luận
2.3.1. Về xây dựng và thẩm định các qui trình phân tích
- Đã xây dựng được 9 quy trình phân tích HPLC và 1 quy trình phân tích AAS, trong đó có 3 quy trình phân tích đồng thời và 7 quy trình phân tích từng chất riêng biệt, như sau:
+ Quy trình phân tích phát hiện, định lượng đồng thời 4 chất màu bị cấm (Metanil yellow, Rhodamin B, Pigment red 53, Pigment orange 5) trong son môi và sơn móng bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích phát hiện, định lượng đồng thời 4 chất màu thuộc nhóm Sudan (Sudan I, II, III, IV) trong son môi và sơn móng bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích phát hiện đồng thời 12 chất màu bị cấm thuộc nhóm steroid trong kem bôi da bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Metanil yellow trong son môi, sơn móng bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Rhodamin B trong son môi, sơn móng, phấn mắt, phấn má bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Pigment red 53 trong son môi, sơn móng, phấn má bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Pigment orange 5 trong son môi, sơn móng bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích phát hiện, định lượng chất màu Crystal violet trong son môi, sơn móng bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích để phát hiện, định lượng Hydroquinon trong kem bôi da bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
+ Quy trình phân tích phát hiện, định lượng thủy ngân trong kem bôi da, sữa rửa mặt, dầu gội đầu, phấn trang điểm bằng phương pháp AAS với kỹ thuật hóa hơi lạnh.
- Đã đánh giá các quy trình phân tích về độ thích hợp hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện, định lượng. Kết quả đánh giá phương pháp cho thấy các phương pháp có độ đặc hiệu cao, độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu, đảm bảo phù hợp với việc áp dụng kiểm tra chất cấm, chất cần kiểm soát hàm lượng trong mỹ phẩm ở mức nồng độ nhỏ.
Giới hạn phát hiện của các quy trình được thiết lập đều đáp ứng được yêu cầu về giới hạn phát hiện đưa ra trong các phương pháp hòa hợp hiện có của ASEAN. Một số phương pháp phân tích có độ nhạy tốt hơn nhiều lần so với phương pháp phân tích chất cấm tương ứng mà ASEAN đã đưa ra.
2.3.2. Về thẩm định chuyển giao phương pháp:
- Đã thẩm định chuyển giao thành công 3 phương pháp hòa hợp của ASEAN để phát hiện và định lượng chì, arsen và Tretinoin. Kết quả đã đưa ra được các thông số phân tích cụ thể về điều kiện xử lý mẫu, thông số thiết bị phân tích. Kết quả cũng chỉ ra rằng các phương pháp hòa hợp này hoàn toàn phù hợp và triển khai được tại Việt Nam với các trang thiết bị sẵn có và các cán bộ được đào tạo về phương pháp phân tích HPLC và quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
- Đã viết được 3 thường quy kỹ thuật để phát hiện và định lượng chì, asen và Tretinoin trong các sản phẩm mỹ phẩm
- Đã có 11/13 quy trình phân tích được phê duyệt và áp dụng thực tế để kiểm tra các chất cấm một cách kịp thời, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng mỹ phẩm, 2 quy trình đang chờ phê duyệt.
2.3.3. Về áp dụng các quy trình và kiểm tra các chất bị cấm trong mẫu mỹ phẩm:
- Đã áp dụng các quy trình xây dựng được, các quy trình đã đánh giá chuyển giao để kiểm tra 12 chất và nhóm chất tương ứng trên hơn 230 lượt mẫu mỹ phẩm, đã phát hiện thấy khoảng 13% số mẫu mỹ phẩm bị nhiễm các chất cấm hay có hàm lượng vượt quá giới hạn cho phép: Metanil yellow, Rhodamin B, Pigment red 53, Crystal violet, các Sudan, thủy ngân, Tretinoin, một số corticoid. Đặc biệt có những mẫu mỹ phẩm có chứa thủy ngân và Pigment red 53 nhiều hơn giới hạn cho phép rất nhiều lần.
2.3.4. Về các bài báo khoa học:
- Có 09 bài báo khoa học về phát hiện và định lượng các chất cấm được đăng tải trên các tạp chí: Tạp chí Kiểm nghiệm Thuốc, tạp chí Dược học, tạp chí Dược và Thông tin thuốc.
2.3.5. Về đào tạo chuyên môn kỹ thuật:
- Đã viết tài liệu đào tạo và triển khai đào tạo kỹ thuật phát hiện và kiểm tra một số chất màu, kim loại nặng: chì arsen, các corticoid bị cấm có mặt trong mỹ phẩm cho 46 trung tâm Kiểm nghiệm thuốc và mỹ phẩm.