Báo Cáo Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
NĂM 2010
MỤC LỤC ( Dài 176 trang)

NỘI DUNG
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN 5
1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI 5
1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý 5
1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với virút dại 7
1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng 8
1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay 9
1.2. TỔNG QUAN VỀ VẮCXIN DẠI 13
1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất 13
1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai 17
1.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO
1.3.1. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 20
1.3.2. Kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 24
1.4. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TẠI VIỆT NAM 31

CHƯƠNG 2-XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 36
2.1. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 39
2.1.1. Các thử nghiệm kiểm tra nước nổi nuôi cấy tế bào 43
2.1.2. Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu 47
2.1.3. Kết quả quy trình nuôi cấy tế bào Vero trên chai tế bào một lớp 48
2.2. QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 49
2.3. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƯỚC NỔI 53
2.3.1. Các phương pháp xác định hiệu giá virút dại 54
2.3.2. Kết quả nuôi cấy virút dại theo các điều kiện nhân nuôi khác nhau 65
2.4. QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 74
2.5. QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT 76
2.6. QUY TRÌNH CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 77
2.7. QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT 79
2.7.1. Thử nghiệm phát hiện ADN tế bào Vero tồn dư trong các sản phẩm của quy trình tinh chế vắcxin dại bằng phương pháp lai điểm 79
2.7.2. Các phương pháp tinh chế virút dại 84
2.8. QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 89
2.9. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 92

CHƯƠNG 3-SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN DẠI Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 94
3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 94
3.2. KẾT QUẢ GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 95
3.3. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƯỚC NỔI 96
3.4. KẾT QUẢ TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 100
3.5. KẾT QUẢ BẤT HOẠT VIRÚT 100
3.6. KẾT QUẢ CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 101
3.7. KẾT QUẢ TINH CHẾ VIRÚT 101
3.8. KẾT QUẢ PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 104
3.9. KẾT QUẢ SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 105
3.10. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VẮCXIN THÀNH PHẨM TẠI CƠ SỞ 105

CHƯƠNG 4 - XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 109
4.1. CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA SINH HỌC 110
4.1.1. Phương pháp kiểm tra vô khuẩn 110
4.1.2. Phương pháp kiểm tra an toàn chung 113
4.1.3. Phương pháp kiểm tra chất gây sốt 116
4.1.4. Phương pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu 119
4.1.5. Phương pháp kiểm tra công hiệu 121
4.1.6. Thử nghiệm nhận dạng 125
4.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA HÓA LÝ 126
4.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số 126
4.2.2. Xác định pH trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 130
4.2.3. Định lượng thimerosal trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 131
4.2.4. Định lượng nhôm trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng 134
4.2.5. Xác định độ ẩm tồn dư trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô 136
4.2.6. Kiểm tra tính chất vật lý vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 139
5.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO 140

CHƯƠNG 5- ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 143
5.1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 144
5.1.1. Các phương pháp đánh giá tính an toàn của vắcxin trên động vật thí nghiệm 144
5.1.2. Các phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên chuột 144
5.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 152
5.2.1. Tính an toàn của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào trên động vật thí nghiệm 152
5.2.2. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero trên động vật thí nghiệm 154
KẾT LUẬN 157
KIẾN NGHỊ 160
TÀI LIỆU THAM KHẢO 161
PHỤ LỤC
MỞ ĐẦU
Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người. Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong do vậy việc tiêm phòng là biện pháp phòng bệnh cũng như điều trị bệnh dại cho hiệu quả cao nhất. Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi phơi nhiễm hàng năm chủ yếu tại các nước châu Á. Tiêm phòng dại sau khi phơi nhiễm đã tránh được trên 300.000 ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này cũng như tỷ lệ đi tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dự tính sẽ tăng lên một cách đáng kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào.
Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dựa trên việc bất hoạt virút trên mô thần kinh. Từ đó trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng trên thế giới. Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn dịch chứa virút. Các vắcxin này đã được sử dụng rộng rãi để phòng bệnh cho cả người và động vật. Tuy nhiên, các vắcxin này có rất nhiều nhược điểm như còn virút sống tồn dư, hay gặp các phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin và hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp đòi hỏi phải có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm. Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể gây ra các phản ứng thần kinh không mong muốn. Do vậy, các vắcxin thế hệ thứ hai sản xuất trên nuôi cấy tế bào đã ra đời nhằm khắc phục các nhược điểm của các dạng vắcxin cổ điển. Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau khi phơi nhiễm với virút. Đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm và thực địa lâm sàng trên người. Ở cả phương pháp tiêm phòng trước và sau khi phơi nhiễm, các vắcxin này đều tạo được đáp ứng kháng thể ở trên 99%
người được tiêm. Sử dụng các vắcxin thế hệ mới kết hợp với xử lý vết cắn đúng cách và tiêm phòng globulin miễn dịch kháng dại đã tạo ra hiệu quả
phòng bệnh dại là 100% thậm chí cả với những trường hợp bị cắn có nguy cơ mắc bệnh cao. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết. Các quốc gia trên thế giới cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp loại vắcxin tiên tiến và cho hiệu quả cao này.
Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của
người dân. Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố trên cả nước. Nếu tính một người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại ) thì trong năm 1995 cả nước tốn gần 100 tỷ đồng. Thêm vào đó, mỗi năm có trên dưới 500 người thiệt mạng do bệnh dại. Trước tình hình nghiêm trọng của bệnh dại, năm 1996, Chính phủ đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng chống bệnh dại và Bộ Y tế đã thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại Quốc gia. Thành công của Chương trình là đến năm 2006 số ca tử vong do bệnh dại đã giảm 81% so với năm 1995. Tuy nhiên, trong năm 2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng lên đến trên 100 trường hợp. Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn gây bệnh mà chủ yếu là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều hạn chế. Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa.
Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Các vắcxin này có chứa một lượng virút chưa bất hoạt và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm nhiều mũi cùng với liều tiêm lớn. Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp). Ưu điểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít myelin của não nên ít gây các tai biến thần kinh hơn. Hiệu giá virút thu hoạch từ não chuột ổ cao hơn do đó tính sinh miễn dịch tốt hơn do vậy làm giảm số liều tiêm. Việc sử dụng vắcxin dại trên não chuột ổ trong hơn 30 năm qua đã góp phần hạn chế nguy cơ tử vong do bệnh dại. Theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước, trên 80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida có các phản ứng không mong muốn, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm. Do các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của Hãng Aventis Pasteur. Tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần 800.000 đồng) do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế.
Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được sản xuất trong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân,
để nhiều người có cơ hội được tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong do bệnh dại, từ năm 2005 nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã hướng đến việc nghiên cứu và phát triển vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Việt Nam. Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin dại, nhóm nghiên cứu đã tiến hành các nghiên cứu ở cấp cơ sở và lựa chọn ra được chủng virút PV (Pasteur Virus) và môi trường nuôi cấy không huyết thanh đạt các yêu cầu cho sản xuất vắcxin. Từ những thành công này, nhóm nghiên cứu bắt đầu tiến hành xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm. Với kinh nghiệm trên 30 năm sản xuất và kiểm định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên não chuột ổ, cùng với những kinh nghiệm và thành công trong việc phát triển các vắcxin mới, VABIOTECH đưa ra các mục tiêu và nội dung trong Đề tài nghiên cứu này với mong muốn sớm có được sản phẩm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào đạt tiêu chuẩn được sản xuất tại Việt Nam.
Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài
1. Xây dựng được qui trình công nghệ ổn định sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiệm.
2. Sản xuất được các loạt vắcxin dại có chất lượng đạt yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới và tương đương với các vắcxin cùng loại của nước
ngoài như vắcxin Verorab của Aventis Pasteur.