Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tu

ĐỀ TÀI: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens

Lời cảm ơn

[TABLE=align: left]
[TR]
[TD][/TD]
[/TR]
[TR]
[TD][/TD]
[TD][/TD]
[/TR]
[/TABLE]











MỤC LỤC
TRANG
PHẦN I. MỞ ĐẦU .1
1.1. Đặt vấn đề .1
1.2. Mục đích của đề tài .2
1.3. ư nghĩa khoa học và ư nghĩa thực tiễn của đề tài 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4
2.1 Một số đặc điểm sinh học của bèo tấm Spirodela polyrrhiza. . 4
2.1.1 Hệ thống phân loại 4
2.1.2 Đặc điểm h́nh thái của bèo tấm 5
2.1.3 Phương thức sinh sản. 5
2.1.4 Phân bố của bèo tấm 6
2.2. Các yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới đời sống bèo tấm 7
2.3. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật .9
2.3.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp 10
2.3.2. phương pháp chuyển gen gián tiếp .12
2.4. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .12
2.4.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 13
2.4.2. Cấu truc và chức năng của đạn T-DNA 14
2.4.3. Cơ chế phân tử của chuyển gen thông qua A.tumefaciens 15
2.4.4. Hệ thống vectơ chuyển gen 16
2.5. T́nh h́nh nghiên cứu xây dung hệ thống chuyển gen
vào bèo tấm .18
2.5.1. T́nh h́nh nghiên cứu thế giới .18
2.5.2. T́nh h́nh nghiên cứu trong nước 20
PHẦN III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22
3.1. Vật liệu nghiên cứu 22
3.1.1. Vật liệu thực vật .22
3.1.2.Vật liệu vi khuẩn và plasmid 22
3.1.3. Hoá chất và máy móc thiết bị phục vụ cho nghiên cứu .23
3.2. Phương pháp nghiên cứu 24
3.2.1. Xây dựng hệ thống chuyển gen vào bèo tấm S. polyrrhiza 24
3.2.2. Quan sát và xác định tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus .27
3.2.3. Phương phỏp tỏch chiết DNA bèo tấm . 27
3.2.4. Phương pháp phân tích PCR .28
3.3. Nội dung nghiên cứu . 29
3.4. Các chỉ tiêu đánh giá 31
PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32
4.1. Xây dựng quy tŕnh chuyển gen vào b̀o tấm S. polyrrhiza 32
4.1.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho các thí nghiệm chuyển
gen ở bèo tấm SP nguyên cây và callus .32
4.1.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của
gen gus ở SP nguyên cây và callus .34
4.1.3.Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm
thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus .35
4.1.4. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
gus ở bèo tấm SP nguyên cây và callus .36
4.2. Chuyển gen bền vững vào callus bèo tấm Spirodela polyrrhiza
thông qua vi khuẩnAgrobacterium .39
4.2.1. Kết quả nuôi cấy phục hồi sau khi đồng nuôi cấy .39
4.2.2. Kết quả chọn lọc sau diệt khuẩn .39
4.2.3. Kết quả tách chiết DNA và phân tích PCR các ḍng bèo
tấm chuyển gen .42
PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .44
5.1. Kết luận 44
5.2. Đề nghị .45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .46

















BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
[TABLE]
[TR]
[TD]ADN[/TD]
[TD]Deoxyribo Nucleic Acid[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]AS[/TD]
[TD]Acetosyringone[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]Bp[/TD]
[TD]base pair[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]CH[/TD]
[TD]Casein hydrolysate[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]Cs[/TD]
[TD]cộng sự[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]EDTA[/TD]
[TD]Ethylene Diamine Tetraacetace Acid[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]Et-Br[/TD]
[TD]Ethidium Bromide[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]gus[/TD]
[TD]β-glucuronidase gene= gen mă hoá β- glucuronidase[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]MCS[/TD]
[TD]Multi-Cloning Site[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]NOS[/TD]
[TD]Nopaline Sythetase[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]NOS-p[/TD]
[TD]Nopaline Sythetase promotor[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]NptII[/TD]
[TD]Neomycin phosphotransferase gene[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]OD600[/TD]
[TD]Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR 800 Spectrophotometer của hăng Beckman Coulter [/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]PCR[/TD]
[TD]Polymerase Chain Reaction[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]SP[/TD]
[TD]Spirodela polyrrhiza[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]T-DNA[/TD]
[TD]Transferred – DNA = DNA chuyển[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]Ti-plasmid[/TD]
[TD]Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u thực vật[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]X-gluc[/TD]
[TD]5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β -D-glucuronic acid[/TD]
[/TR]
[/TABLE]


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề

Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính mới nh­chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đă đạt 125 triệu ha. Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn, chịu mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học đă được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (James, 2008).
Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các dược chất, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine (Mason & cs, 1998).
Có nhỉu hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là t́m kiƠm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Vaccine do thực vật sản xuất thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là “Vaccine sản xuất bằng thực vật” (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dịch toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003).ư tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đó lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đă thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003).