Thạc Sĩ Nghiên cứu xây dựng qui trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp. Làm nguyên liệu probiot

GIỚI THIỆU U N ÁN
1. Đặt vấn đề
Trong nh ng năm gần đây, việc dùng nguồn vi khuẩn để sản xuất một số
carotenoid quan trọng đã được quan tâm nghi n cứu. Việc sử dụng vi
khuẩn sinh carotenoid làm nguy n liệu sản xuất thực phẩm chức năng có
nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy ở qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụng
cơ chất giá thành thấp, ngoài ra còn có nh ng giá trị cộng th m như có
thể bổ sung th m các men trợ ti u hóa, ổn định trong bảo quản. Trong số
các vi khuẩn sinh carotenoid, Bacillus có nhiều ưu điểm vì ch ng có khả
năng tạo bào tử bền với nhiệt n n dễ bảo quản và sản xuất.
Tr n thế giới và tại Việt Nam chưa có nhiều nghi n cứu sâu, toàn diện về
Bacillus sinh carotenoid để cung cấp carotenoid. Mục ti u luận án
nghi n cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp. làm
nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid, hướng đến nội dung sau:
1. Phân lập Bacillus sinh carotenoid, khảo sát đặc điểm probiotic.
2. Khảo sát khả năng sinh carotenoid từ các vi khuẩn phân lập được.
3. Khảo sát môi trường thay thế và điều kiện nuôi cấy để xây dựng quy
trình l n men.
4. Xây dựng quy trình l n men ở quy mô pilot để sản xuất sinh khối
Bacillus làm nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid.
5. Xây dựng ti u chuẩn cơ sở của nguy n liệu.
6. Nghi n cứu khả năng ứng dụng sinh khối thu được.
2. Tính cấp thiết của đề tài
Các chất chống oxi hóa trong tự nhi n được quan tâm và nghi n cứu rất
nhiều như flavonoid, carotenoid, polyphenol, trong đó, carotenoid
được ch nhiều vì có thể làm giảm t lệ m c các bệnh mạn t nh như
ung thư, tim mạch, ch a các bệnh về m t. Các carotenoid sử dụng trong 2


các chế phẩm thường được chiết xuất từ thực vật hoặc tổng hợp hóa học,
có nhiều nhược điểm như sử dụng các dung môi chiết xuất độc hại ảnh
hưởng đến môi trường, phụ thuộc vào thời tiết, carotenoid k m bền khó
bảo quản,
Việc sử dụng bào tử vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid dưới dạng
probiotic, cung cấp carotenoid ngay trong đường ti u hóa có nhiều ưu
điểm như thời gian nuôi cấy ng n, không qua chiết xuất, bảo quản
carotenoid đơn giản, là một hướng tiếp cận mới về nguồn và phương
thức cung cấp carotenoid so với cách thức truyền thống là chiết xuất hay
tổng hợp hóa học tồn tại nhiều nhược điểm đã n u.
3. Những đóng góp mới của luận án
Đây là nghi n cứu đầu ti n sử dụng bào tử Bacillus làm nguồn cung cấp
carotenoid tại Việt Nam. Nghi n cứu này mở ra một hướng tiếp cận mới
về nguồn và phương thức cung cấp carotenoid, với nh ng đóng góp mới
cụ thể như sau:
- Phân lập, định danh được hai chủng vi khuẩn Bacillus tại Việt Nam là
Bacillus marisflavi DD1.1 và Bacillus infantis AT14, đáp ứng y u
cầu làm nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid.
- Xây dựng được quy trình l n men thu sinh khối bào tử ổn định ở quy
mô pilot, với các thông số phù hợp, sử dụng nguy n liệu giá thành
thấp, s n có tại Việt Nam, quy trình có t nh kinh tế, có thể ứng dụng
vào thực tế tạo n n sản phẩm có giá cạnh tranh.
- Chứng minh được khả năng hấp thu carotenoid tại ni m mạc ruột, khả
năng điều trị ti u chảy do kháng sinh tr n mô hình động vật có v đối
với hai chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được. 3


4. Bố cục luận án
Luận án gồm: 139 trang, đặt vấn đề 2 trang, tổng quan tài liệu 26 trang,
đối tượng - vật liệu - thiết bị và phương pháp nghi n cứu 21 trang, kết
quả nghi n cứu 72 trang, bàn luận 14 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang.
Luận án có 71 bảng, 23 hình, 7 sơ đồ, 118 tài liệu tham khảo, gồm 11 tài
liệu tiếng Việt, 107 tài liệu tiếng Anh, 13 phụ lục thể hiện các kết quả
thực nghiệm.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI IỆU
1.1. Thực phẩm chức năng: khái niệm, ti u ch .
1.2. Probiotic: khái niệm, các ti u ch về probiotic.
1.3. Thực phẩm chức năng và probiotic đối với sức khỏe: tác dụng của
thực phẩm chức năng và probiotic đối với sức khỏe, y học.
1.4. Carotenoid: cấu tr c, phân loại, đặc t nh l hóa, tác dụng sinh học
và vai của carotenoid trong y học, các phương pháp định lượng,
định t nh carotenoid.
1.5. Các vi sinh vật sinh carotenoid: trình bày về chi sinh carotenoid và
các loại carotenoid đặc trưng được sinh ra.
1.6. Vi khuẩn Bacillus: đặc điểm của vi khuẩn và bào tử Bacillus, các
ứng dụng.
1.7. L n men và sản xuất sinh khối: các vấn đề môi trường l n men, yếu
tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật.
1.8. Nghi n cứu vi khuẩn sinh carotenoid thế giới và tại Việt Nam: tóm
t t các nghi n cứu tr n thế giới và trong nước về tình hình nghi n
cứu vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid. Chưa có nhiều nghi n cứu về
vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid. 4


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, V T IỆU, THIẾT BỊ
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu: vi khuẩn (VK) phân lập từ mẫu đất và nước
ở à Rịa - V ng Tàu, ình Thuận, Nha Trang và Đà N ng.
2.2. Vật liệu
s n v t v n v t t n m: chủng vi khuẩn ATCC, hoặc từ dự
án Colorspore, hoặc do PTN Vi sinh Công nghệ Dược. Chuột nh t tr ng
Swiss albio, Viện Pasteur Nha Trang.
t Sigma, Merck, hoặc các công ty dược trong nước.
M tr n TSA, TS , NA, N của Ấn Độ. MHA (Đức).
2.3. Thiết
Máy luân nhiệt Mastercycler Personal (Eppendorf), ộ điện di ngang
Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad), Máy quang phổ UV-Vis GeneQuant 1300
(GE HealthCare), Máy tán si u âm VCX 130P (Sonics), hệ thống
HPLC Smartline 2500 (Knauer), .
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phân lập chủng VK, sàng lọc, đ nh danh
T u t p mẫu t v n ớ Vùng biển Cần Giờ, à Rịa - V ng Tàu, Đà
N ng, ình Thuận, Nha Trang.
P ân l p Trực khuẩn Gram (+), sinh bào tử, có màu sẽ được lưu lại để
nghi n cứu sàng lọc khả năng sinh carotenoid.
S n lọ : hoạt t nh chống oxy hóa, phổ UV-Vis dịch chiết sinh khối.
Địn d n : Dựa tr n giải trình tự gen 16S rADN.
2.4.2. Khảo sát đặc điểm pro iotic
K ả năn s n enzym n oạ b o ủ ủn v k uẩn: khả năng sinh
protease (caseinase, gelatinase), amylase, lipase. 5


T k ả năn ố k án vớ VK ây b n (chủng ATCC): S. aureus, E.
coli, S. faecalis, P. aeruginosa, Sal. paratyphi A, K. pneumoniae.
K ả năn ịu d dị vị v muố m t Khả năng sống sót VK sau 30,
60, 90 ph t ở pH 2, 3; sau 1, 3 giờ ở muối mật 0,15%, 0,3%.
T n m n ạy ảm k án s n : PP pha loãng kháng sinh trong thạch
theo M7 - A9 và M45 – A (CLSI). Sử dụng 15 kháng sinh đại diện cho
các nhóm penicilin, cephem, glycopeptid, aminoglycosid, macrolid,
tetracyclin, quinolon, phenicol, ansamycin.
2.4.3. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và đường cong tăng trưởng
Đ ều k n p át tr ển ủ v k uẩn từ 20 - 45
o C, từ pH 6 - 11.
Đ n on tăn tr ởn trên TSB đo OD mỗi giờ, đếm sống để kiểm
chứng. Xác định thời gian thế hệ.
2.4.4. Khảo sát đặc điểm sinh carotenoid
Xá ịn m l ợn roteno d bằn PLC (Knauer - Đức):
acetonitril:methanol:dicloromethan (7:2:1, tt/tt), RP18 (250 mm, 4,6
mm, 5 àm); UV-Vis, λ 450nm ; 1 ml/ ph t; t o
phòng; 20àl. Xác định hàm
lượng carotenoid qua đường chuẩn canthaxanthin.
K ảo sát sự tạo roteno d t eo t n Đường cong tăng trưởng: mỗi
giờ, đo OD tr n cùng 1 erlen. Hàm lượng carotenoid: định lượng bằng
HPLC (với thông số như tr n), mỗi 6 giờ (thử nghiệm sơ bộ) hoặc 2 giờ.
2.4.5. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy
K ảo sát MT t y t ế cho TSB: Khoai tây, b p, gạo, đậu nành, đối chứng
với TS , chọn MT có sinh khối và carotenoid ≥ MT TS .
K ảo sát k ả năn tạo b o t trên á MT t eo t n
ã So sánh sự tạo bào tử gi a MTTT bổ sung K
+
, Mg
2+
, Mn
2+
, Ca
2+
, Fe
2+

với DSM, TSM, 2SG (cả hai dạng lỏng và r n). 6


ã Khảo sát ảnh hưởng của 5 khoáng đến khả năng tạo bào tử và
carotenoid: phương pháp bề mặt đáp ứng – RSM.
K ảo sát á t n số lên men tron MT lỏn : T lệ truyền chủng, tốc
độ khuấy, pO 2 .
2.4.6. Xây dựng tiêu chuẩn ột sinh khối ào tử
Dựa tr n chuy n luận chế phẩm iosubtyl trong DĐVN IV.
2.4.7. Thử nghiệm độc tính, sinh khả dụng trên chuột
Đ tín p 14 ngày. Đối tượng: DD1.1; AT14. Đối chứng: NaCl
0,85%, HU58 (B.subtilis). Liều: 10
7
, 10
8
, 5x10
9 bào tử/g TTC.
Xác định LD 50 . Giải phẫu đại thể: tìm bất thường trong nội tạng.
Đ tín bán tr n d ễn: 60 ngày. Đối tượng: DD1.1; AT14. Đối
chứng: NaCl 0,85%, HU58 (B.subtilis). Liều: 10
7
bào tử/g TTC.
- Theo dõi: biểu hiện bất thường.
- X t nghiệm: bất thường sinh hóa/ huyết học.
- Vi phẫu: bất thường mô học nội tạng.
S n k ả dụn trên u t 60 ngày. Đối tượng: DD1.1; AT14. Đối
chứng: NaCl 0,85%, HU58 (B.subtilis), dầu gấc (β-caroten). Liều: 10
6

bào tử/g TTC.
Đánh giá t ch l y carotenoid trong gan.
2.4.8. Ứng dụng nguyên liệu sinh khối
2.4.8.1. Đ ều trị t êu ảy do k án s n
Gây ti u chảy chuột bằng streptomycin và lincomycin, duy trì bằng ¼
liều, 1 lần/ngày. Thử nghiệm: AT14, DD1.1, S02 (1 VK hay 2 VK, 2
lần/ngày). Quan sát phân chuột hàng ngày đến hết ti u chảy.
B sun v k uẩn v o sữ u : Mẫu thử: DD1.1, AT14 (10
6
–
5x10
8
bào tử/ml). Mẫu chứng: không có bào tử VK. 7


Đánh giá cảm quan s a chua bổ sung VK sinh carotenoid: mùi, hương
vị, kết cấu (điểm 9 rất th ch - 1 rất không th ch).
Khảo sát độ ổn định của bào tử trong s a chua: từ ngày 1 - 45.
3 K ảo sát n ịn b o t DD1 1, AT1 ốm, ỗn dị
Cốm, hỗn dịch bảo quản ở 25 - 30
o C. Sau 3, 6, 9 và 12 tháng: trải mẫu
theo dõi độ ổn định của bào tử VK.