Thạc Sĩ Nghiên cứu xác định người lành mang gen và ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh Hemophilia A

ĐẶT VẤN ĐỀ

1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh máu khó đông hemophilia A là bệnh di truyền alen lặn
liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X không có
alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y, do vậy người mẹ mang gen
bệnh có thể truyền bệnh cho 50% con trai và truyền gen bệnh cho
50% con gái. Bệnh có thể di truyền qua nhiều thế hệ và có nhiều
người mắc bệnh trong cùng một gia đình. Bệnh ảnh hưởng đến tâm
sinh lý, thể chất trẻ nhỏ và là gánh nặng cho gia đình và xã hôi. Tại
Việt Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia và
khoảng 30.000 người mang gen bệnh hemophilia. Mặc dù trong thời
gian qua, công tác chăm sóc bệnh nhân hemophilia A tại Việt Nam đã có
nhiều tiến bộ, số lượng bệnh nhân được chẩn đoán và quản lí đã tăng lên
đáng kể, tuy nhiên mới chỉ chiếm chưa tới 30% tổng số người bị bệnh và
đa số người mang gen bệnh chưa được chẩn đoán và quản lí. Việc phát
hiện người lành mang gen bệnh đóng vai trò quan trọng trong công tác
tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh để có thể giúp ngăn ngừa sinh
con bị bệnh và giảm tỷ lệ mắc bệnh.
2. Mục tiêu của đề tài:
1. Phát hiện người lành mang gen bệnh ở các thành viên gia đình
bệnh nhân hemophilia A đã xác định được đột biến gen F8.
2. Ứng dụng kỹ thuật I-PCR và giải trình tự gen chẩn đoán trước
sinh cho những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh
hemophilia A.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
Phát hiện người phụ nữ mang gen bệnh bằng các xét nghiệm
thông thường như xác định hoạt tính yếu tố VIII trong máu còn gặp
khó khăn vì hoạt tính yếu tố VIII của họ không giảm hoặc giảm ít, có
thể dao động từ 50 – 150%, chỉ có khoảng 10% tổng số những phụ
nữ này có hoạt tính yếu tố VIII huyết tương <10% và có biểu hiện
chảy máu.
Ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về bệnh hemophilia
A đã được công bố, chủ yếu là các nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng
và cận lâm sàng, tần suất mắc bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh
bằng các chế phẩm thay thế; nghiên cứu về tính chất gia đình của
bệnh hemophilia A, nghiên cứu phát hiện người lành mang gen bệnh
bằng phân tích một số yếu tố đông máu; nghiên cứu phát hiện người
lành mang gen bệnh sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (RFLP -
Restriction Fragment Length Polymorphisms) chỉ phát hiện được 4/9
người mẹ mang gen bệnh (44,4%) .Tuy nhiên các nghiên cứu này
dựa trên cỡ mẫu nhỏ, phương pháp phát hiện gián tiếp, tỷ lệ người
lành mang gen phát hiện được thấp và như vậy vẫn chưa có một nghiên
cứu đầy đủ và toàn diện về tình trạng mang gen bệnh của các thành viên
nữ có nguy cơ cao trong gia đình bệnh nhân hemophilia A.
Sử dụng phương pháp phát hiện trực tiếp (bằng kỹ thuật I-
PCR và giải trình tự gen), đề tài đã xác định chính xác tình trạng
mang gen bệnh của các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân
hemophilia A (đã phát hiện được đột biến gen F8) tạo cơ sở khoa học
cho công tác tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, có thể ngăn
ngừa việc sinh ra những đứa trẻ bị bệnh hemophilia A. Đây là nghiên
cứu xác định người lành mang gen F8 đột biến đầu tiên được thực
hiện ở Việt Nam, có ý nghĩa khoa học và nhân văn sâu sắc.
4. Cấu trúc luận án:
- Luận án được trình bày trong 126 trang (không kể tài liệu
tham khảo và phần phụ lục). Luận án được chia làm 7 phần:
+ Đặt vấn đề: 2 trang
+ Chương 1: Tổng quan tài liệu 34 trang
+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 16 trang
+ Chương 3: Kết quả nghiên cứu 41 trang
+ Chương 4: Bàn luận 31 trang
+ Kết luận: 1 trang
+ Kiến nghị: 1 trang
Luận án gồm 10 bảng, 2 biểu đồ và 53 hình. Sử dụng 113 tài
liệu tham khảo gồm tiếng Việt, tiếng Anh và một số trang Web. Phần
phụ lục gồm bệnh án nghiên cứu, danh sách 166 thành viên nữ trong
các gia đình bệnh nhân hemophilia A, kết quả phát hiện người lành
mang gen bệnh, sơ đồ phả hệ của 6 gia đình chẩn đoán trước sinh và
hình ảnh minh họa. Chương 1: TỔNG QUAN
1. Đặc điểm bệnh hemophilia A
Bệnh máu khó đông (hemophilia A) là một bệnh di truyền hay
gặp nhất do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông
máu (yếu tố VIII) trong huyết tương.
Theo thống kê của tổ chức Hemophilia thế giới (WFH), hiện
nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có
khoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu [19]. Tỷ lệ mắc bệnh
hemophilia A gần giống nhau ở các vùng địa lý, các nước, các
chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000 dân.
Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000  1/5.000 trẻ trai.
Tại Việt Nam, hiện tại có khoảng 6000 bệnh nhân hemophilia
và có khoảng 2.200 (chiếm gần 40%) bệnh nhân được phát hiện và
chăm sóc thường xuyên. Như vậy, tỷ lệ bệnh nhân chưa được chẩn
đoán và điều trị vẫn còn ở mức cao.
Chẩn đoán xác định bệnh Hemophilia A dựa vào 3 đặc điểm:
(1) Triệu chứng laanm sàng: có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu; (2) Dựa
vào tiền sử gia đình; (3) Xét nghiệm máu trong đó quan trọng nhất là
hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%.
Cơ chế phân tử bệnh hemophilia A: Gen quy định tổng hợp
yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính X, là một trong
những gen lớn nhất của người, có kích thước 186 Kb gồm 26 exon,
trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp đến 262 bp và 2 exon lớn
nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), mã hóa 9 Kb
mRNA. Đột biến gen F8 gây thiếu hụt hoặc bất thường chức năng
protein yếu tố VIII, làm ngừng trệ dòng thác đông máu theo con
đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu kéo dài, không cầm ở
bệnh nhân hemophilia A
Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A:
dạng đột biến điểm (thay thế nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc
vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%) tiếp đến là dạng đột biến
đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và intron 22 (36,7%), còn lại là
đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 – 15%. Tùy thuộc vào
kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặng nhẹ
khác nhau.
2. Người lành mang gen bệnh hemophilia A
Người lành mang gen bệnh hemophilia A là người mang một
nhiễm sắc thể X bị đột biến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình
thường, chính vì vậy mà đa số họ không biểu hiện bệnh.
Con gái của một bệnh nhân hemophilia A, người mẹ của hai
con trai bị bệnh; người mẹ của một con trai bị bệnh hoặc một con gái
mang gen bệnh và có một người nam cùng huyết thống trong phả hệ
gia đình bị bệnh; là những người chắc chắn mang gen F8 bị đột biến
theo quy luật di truyền, được gọi là người lành mang gen bệnh bắt
buộc (obligate carrier). Bà ngoại của một cháu trai bị bệnh
hemophilia A, con gái của một người mẹ mang gen bệnh hemophilia
A, dì và em gái của một bệnh nhân hemophilia A là những người có
nguy cơ cao mang gen bệnh (possible carrier).
Người phụ nữ có biểu hiện bệnh máu khó đông tương tự như
một trường hợp hemophilia A thể nhẹ thì khi đó gọi là người lành
mang gen bệnh có triệu chứng (symptomatic carriers). Khoảng 10%
người mang gen có hoạt tính yếu tố VIII huyết tương thấp hơn so với
bình thường, thậm chí một số ít trường hợp người mang gen bệnh có
hoạt tính yếu tố VIII huyết thanh rất thấp dưới 4% gây chảy máu
tương tự thể bệnh nặng, với nồng độ yếu tố VIII từ 5% đến 40% có
thể bị chảy máu tương tự như bệnh nhân thể nhẹ. Khoảng 20% người
lành mang gen bệnh biểu hiện triệu chứng chảy máu với các mức độ khác nhau, bao gồm cả những người có hoạt tính yếu tố VIII huyết
tương trong giới hạn bình thường (40 đến 60%).
Với những thành viên nữ mang gen bệnh, việc xác định chính
xác tình trạng mang gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử giúp các nhà
tư vấn sớm đưa ra lời khuyên di truyền trước khi kết hôn để họ tăng
cường nhận thức về bệnh, làm giảm tỷ lệ mang thai và tỷ lệ trẻ sinh
ra bị mắc bệnh hemophilia A.
Xác định tình trạng mang gen để giúp người phụ nữ có các
biện pháp tăng hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh tật, đồng thời
nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng và xã hội.
3. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh
hemophilia A
- Các xét nghiệm đông máu
Xét nghiệm định lượng hoạt tính yếu tố VIII huyết thanh thường
thấp hơn giá trị bình thường (50-150%). Tuy nhiên cũng chỉ phát hiện
được khoảng 10-20% người lành mang gen có biểu hiện bệnh thể nhẹ và
có hoạt tính yếu tố VIII huyết thanh < 35%, số người còn lại có hoạt tính
yếu tố VIII huyết thanh dao động trong khoảng 40 – 60% và không có
triệu chứng bệnh. Do vậy xét nghiệm này không phát hiện được rất
nhiều các trường hợp người lành mang gen bệnh.
- Phát hiện người lành mang gen bệnh dựa vào phân tích phả hệ
Đối với những trường hợp bệnh nhân có tiền sử gia đình rõ
ràng, dựa vào kết quả phân tích phả hệ có thể xác định chắc chắn tình
trạng mang gen của các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân. Tuy
nhiên phương pháp này cũng chỉ phát hiện được số lượng hạn chế
người mang gen bệnh và các thông tin được thu thập để xây dựng phả
hệ đòi hỏi phải thật chính xác và bị ảnh hưởng bởi yếu tố chủng tộc.
Kỹ thuật này cũng không áp dụng được cho những trường hợp bệnh
đơn lẻ trong gia đình.

- Phát hiện người lành mang gen bệnh bằng các kỹ thuật sinh học phân tử
+ Phương pháp phát hiện đột biến trực tiếp: Là phương pháp phát
hiện tình trạng mang gen của người mẹ và các thành viên nữ trong
gia đình dựa trên đột biến chỉ điểm đã xác định được trên bệnh nhân
hemophilia A. Phương pháp này phát hiện được 99-100% các trường
hợp người lành mang gen bệnh. Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật I-
PCR phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22, kỹ thuật giải trình tự toàn
bộ 26 exon để phát hiện đột biến điểm và xóa đoạn, đây là những
phương pháp hiện đại, chính xác, xác định tình trạng mang gen bệnh
của các thành viên viên nữ có nguy cơ cao trong các gia đình bệnh
nhân hemophilia A.
+ Phương pháp phát hiện gián tiếp: Phân tích liên kết được sử dụng
trong nhiều năm gần đây, sử dụng enzym cắt giới hạn Bcl I, Hind III
và intron7 G > A (c.1010 – 27G > A) cộng với đa hình STR trong
intron 13 và 22. Phương pháp phân tích liên kết thực hiện nhanh,
tương đối rẻ tiền, đáng tin cậy để phát hiện các trường hợp bị bệnh
hemophilia A trong phả hệ gia đình có nhiều người bị bệnh. Tuy
nhiên, phương pháp phân tích liên kết không thể phát hiện được
người lành mang gen trong các gia đình có đột biến mới phát sinh
trong quá trình hình thành giao tử.
4. Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A
Kết quả phân tích gen cho biết thai phụ có mang gen bệnh hay
không là yếu tố sàng lọc quan trọng nhất. Sau quá trình phân tích sàng
lọc, những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A được
tiến hành lấy mẫu tế bào thai nhi để phân tích và xác định đột biến.
5. Các nghiên cứu về người lành mang gen bệnh ở Việt Nam
Các nghiên cứu về căn bệnh này ở nước ta mới chỉ tập trung chủ yếu vào tỉ lệ mắc bệnh, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, điều trị và
những tác động tâm lý của bệnh đối với bệnh nhân và thành viên gia
đình. Như vậy còn để ngỏ việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
trong việc phân tích, phát hiện đột biến gen F8, người lành mang gen
bệnh và chẩn đoán trước sinh.

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Gồm 50 gia đình bệnh nhân hemophilia A đã được xác định đột
biến gen F8 (tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y
Hà Nội) bao gồm:
- 50 người mẹ bệnh nhân.
- 116 thành viên nữ (bà ngoại, bà họ, bác gái, dì, chị, em gái ) có
cùng huyết thống với bệnh nhân.
- 12 thai phụ/166 thành viên gia đình bệnh nhân trong đó 6/12 thai
phụ là người lành mang gen bệnh, đang mang thai ở tuần thai thứ 12-18.
- 20 người (10 nam, 10 nữ) khỏe mạnh, tiền sử gia đình không có
người mắc bệnh di truyền dùng để chuẩn hóa kỹ thuật và làm mẫu đối
chứng cùng với mẫu nghiên cứu khi thực hiện các kỹ thuật sinh học
phân tử để phân tích gen.
Các đối tượng nghiên cứu được lấy mẫu nghiên cứu: Máu tĩnh
mạch có chống đông EDTA, dịch chọc ối (thai phụ).
2.2. Phương pháp nghiên cứu:
Sử dụng phương pháp nghiên cứu tiến cứu và mô tả cắt ngang
2.3. Địa điểm nghiên cứu
+ Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, trường Đại học Y Hà Nội.
+ Thời gian từ 1/2012 – 6/2014.
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu:

























2.4. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
- Phân tích phả hệ gia đình các bệnh nhân.
- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu.
- Phản ứng PCR khuếch đại 26 exon gen F8.
- Kỹ thuật giải trình tự gen phát hiện đột biến điểm và mất đoạn nhỏ.
- Kỹ thuật I-PCR (Inversion-PCR) xác định đột biến đảo đoạn intron 22.
- Nuôi cấy tế bào ối.
2.5. Đề tài tuân thủ chặt chẽ đạo đức nghiên cứu trong Y học.
Mang thai
50 bệnh nhân hemophilia A đã
xác định đột biến gen F8
Xây dựng 50 phả hệ
Phát hiện người lành
mang gen bệnh chắc chắn
(Mẹ, chị, em gái )

Chẩn đoán
trước sinh
Tư vấn đình
chỉ thai
Tư vấn
giứ thai
Không đột biến Có đột biến
Xác định người có nguy
cơ cao mang gen bệnh
(Mẹ, chị, em gái )
Xét nghiệm gen F8
- Kỹ thuật I-PCR(đảo đoạn int22)
- Giải trình tự gen (đột biến điểm,
mất đoạn nhỏ)
Mang gen bệnh Không mang gen
Không chẩn
đoán trước
Không xét
nghiệm gen
Không mang
Tư vấn di truyền
và phòng bệnh Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm của các đối tượng nghiên cứu
Bảng 3.
1. Phân b
ố đối tượng nghi
ên c
ứu theo quan hệ với bệnh nhân

Quan hệ với bệnh nhân n Tỷ lệ %
Mẹ bệnh nhân 50 30,1
Các thành viên nữ (bà, bác, dì và chị em gái) 116 69,9
Tổng 166 100

Nhận xét: Trong 166 thành viên nữ của 50 gia đình bệnh nhân
hemophilia A có 50 người mẹ, chiếm tỷ lệ 30,1% và 116 người bao
gồm bà, bác, dì và chị em gái của bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 69,9%.
3.2. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh hemophilia A
3.2.1. Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh qua phân tích phả hệ
Bảng 3.2. Tỷ lệ người lành mang gen bệnh phát hiện được dựa vào
phả hệ
Tình trạng mang gen

Thành viên gia đình
Mang gen
bệnh bắt buộc
(n,%)
Có nguy cao
mang gen bệnh
(n,%)
Tổng
(n,%)
Mẹ bệnh nhân 20 (40%) 30 (60%) 50
Thành viên nữ khác 23 (20%) 93 (80%) 116
Tổng 43 (26%) 123 (74%) 166

Nhận xét: Phân tích phả hệ cho thấy 20/50 người mẹ (chiếm tỷ lệ 40%)
và 23/116 thành viên nữ (chiếm tỷ lệ 20%) mang gen bệnh bắt buộc;
30/50 người mẹ (chiếm tỷ lệ 60%) và 93/116 thành viên nữ người có
nguy cơ cao mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 80%); 43/166 người chắc chắn
mang gen bệnh (chiếm tỷ lệ 26%) và 123/166 người có nguy cao mang
gen bệnh (chiếm tỷ lệ 74%);
3.2.2. Kết quả tách chiết DNA
DNA tổng số từ máu toàn phần được tách theo phương pháp
phenol/chloroform. Nồng độ DNA tổng số tách được có giá trị từ
150 – 1200 ng/l và độ tinh sạch của các mẫu đạt yêu cầu với tỷ lệ
mật độ quang đo được ở bước sóng 260/280 nm luôn nằm trong
khoảng 1,8-2,0.
3.2.3. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng các
phương pháp phân tích gen
3.2.3.1. Kết quả phát hiện người lành mang gen F8 đột biến đảo đoạn
intron22











Hình 3.4. Hình
ảnh multiplex
PCR x
ác định đột biến intron 22
c
ủa

gia đ
ình b
ệnh nhân HA02

Nhận xét: DNA của người bình thường ở vị trí giếng số 1 có 1
băng kích thước tương ứng 487 bp. DNA của bệnh nhân HA02 bị
đột biến đảo đoạn intron 22 ở giếng số 2 có 1 băng kích thước
tương ứng 559 bp.
DNA của người mẹ, bác gái và chị gái họ của bệnh nhân ở giếng
số 3, 4 và 6 có 2 vạch kích thước tương ứng là 487 và 559 bp, như vậy
người mẹ bệnh nhân (II 3 ), bác gái (II 1 ) và chị gái họ của bệnh nhân (III 2 )
là người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử.
DNA của người dì ở giếng số 5 có 1 băng kích thước tương ứng
487 bp giống người bình thường, như vậy dì của bệnh nhân (II 5 ) không
mang gen bệnh, do đó con gái của dì (em họ bệnh nhân-III 5 ) cũng không
mang gen bệnh.
M: Marker 100bp 3 : M b nh nhân (II 3 )
1: Ng i bình th ng (ch ng âm) 4: Bác gái b nh nhân (II 1 )
3: B nh nhân (III 4 ) 5: Dì b nh nhân (II 5 )
6: Ch gái h b nh nhân (III 2 )
500
559 bp
487 bp