Thạc Sĩ Nghiên cứu xác định hàm lượng Meloxicam trong mẫu dược phẩm và mẫu sinh học bằng phương pháp Von – A

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC – HÓA HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2011

MỤC LỤC

Lời cảm ơn . iv
Các ký hiệu viết tắt v
Chỉ dẫn các bảng số liệu . vi
Chỉ dẫn các hình vẽ viii

PHẦN TỔNG QUAN
Chương 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ MELOXICAM. . 1

1.1. MỞ ĐẦU . 1
1.2. CÔNG THỨC, TÍNH CHẤT VẬT LÝ, HÓA HỌC, CƠ CHẾ . 2
1.2.1. Công thức 2
1.2.2. Tính chất vật lý . 2
1.2.3. Tính chất hóa học . 2
1.2.4. Hàm lượng 3
1.2.5. Cơ chế tác động . 3
1.2.6. Độc tính . 4
1.2.7. Mục đích của việc xác định MLC . 4

Chương 2 : CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH . 5

2.1. PHƯƠNG PHÁP VON – AMPE . 5
2.1.1. PHƯƠNG PHÁP VON – AMPE HÒA TAN . 5
2.1.2. CÁC YẾU TỐ TRONG QUÁ TRÌNH TÍCH GÓP VÀ HÒA TAN: . 5
2.1.2.1 QUÁ TRÌNH TÍCH GÓP 5
2.1.2.2 QUÁ TRÌNH HÒA TAN . 10
2.1.3. ĐIỆN CỰC LÀM VIỆC 11
2.1.4. ĐIỆN CỰC RẮN . 11
2.1.4.1. ĐIỆN CỰC GLASSY CARBON . 11
2.1.4.2. CƠ CHẾ PHẢN ỨNG OXI H ÓA CỦA MELOXICAM TRÊN ĐIỆN
CỰC GC 12
2.2.2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO, ĐẦU DÒ
UV – VIS (RP - HPLC – UV/ VIS) 13
PHẦN THỰC NGHIỆM . 14

Chương 3: KHẢO SÁT QUY TRÌNH PHÂN TÍCH . 15

3.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ . 15
3.1.1 HÓA CHẤT: . 15
3.1.2. THIẾT BỊ . 15
3.2. TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ THÔNG SỐ . 16
3.2.1. KHẢO SÁT ĐIỆN CỰC GLASSY CARBON . 16
3.2.2. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THẾ VÀ THỜI GIAN HOẠT HÓA ĐẾN CƯỜNG ĐỘ DÒNG HÒA TAN MLC 17
3.2.3 KHẢO SÁT ĐỘ LẶP LẠI CỦA CƯỜNG ĐỘ DÒNG . 19
3.2.4. KHẢO SÁT NỀN 20
3.2.5. KHẢO SÁT DUNG MÔI 21
3.2.6. pH DUNG DỊCH VÀ NỒNG ĐỘ ĐỆM . 22
3.2.7. THỜI GIAN TÍCH GÓP . 24
3.2.8. THẾ TÍCH GÓP 25
3.2.9. TỐC ĐỘ QUÉT THẾ VÀ BIÊN ĐỘ XUNG . 26
3.2.10. KHẢO SÁT TỐC ĐỘ KHUẤY 27
3.2.11. CÁC CHẤT GÂY NHIỄU 29
3.2.11.1.CÁC CHẤT CÙNG HỌ OXICAM . 29
3.2.11.2. ẢNH HƯỞNG CỦA LACTOSE 29
3.2.11.3. ẢNH HƯỞNG CỦA URE 30
3.2.12. ĐƯỜNG CHUẨN, GIỚI HẠN PHÁT HIỆN, GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG32
3.2.12.1 KHẢO SÁT ĐƯỜNG CHUẨN . 32
GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG TRÊN MẪU NƯỚC TIỂU 35

Chương 4 : PHÂN TÍCH MẪU MELOXICAM 37

4.1. PHÂN TÍCH MẪU MELOXICAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM: . 37
4.1.1. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU DƯỢC PHẨM 37
4.1.1.1. XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PHỔ UV . 37
4.1.1.2 XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO, ĐẦU DÒ UV – VIS (RP-HPLC–UV/VIS) 37
4.1.1.3. XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG VON AMPE DÙNG GCE 37
4.1.2. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU DƯỢC PHẨM . 38
4.1.2.1 MẪU MEBILAX 7.5mg – DƯỢC HẬU GIANG - VIỆT NAM . 38
4.1.2.2. MẪU MELOXICAM 7.5mg – DƯỢC BẾN TRE – VIỆT NAM . 43
4.1.2.3. MẪU MOBIMEX 7.5mg – DƯỢC PYMEPHARCO – VIỆT NAM . 46
4.1.2.4. MẪU MOBIC 7.5 mg – ĐỨC 49
4.2. PHÂN TÍCH MẪU MELOXICAM TRONG MẪU SINH HỌC LÀ MẪU NƯỚC
TIỂU: . 51
4.2.1. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU NƯỚC TIỂU . 51
4.2.2. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU NƯỚC TIỂU 52

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

5.1. KẾT QUẢ 54
5.2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 57
5.2.1. KẾT LUẬN . 57
5.2.2. KIẾN NGHỊ . 57
PHỤ LỤC 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 60



DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 1: các thông số kỹ thuật cài đặt cho máy Von – Ampe . 16
Bảng 2. Các số liệu khảo sát thế hoạt hóa điện cực glassy carbon . 18
Bảng 3. Các số liệu khảo sát thời gian hoạt hóa điện cực glassy carbon 18
Bảng 4. Khảo sát độ lặp lại của cường độ dòng, MLC 2 àg /mL 19
Bảng 5. Cường độ dòng của Meloxicam 2 àg /mL trong các dung môi . 22
Bảng 6: Cường độ dòng Meloxicam 2 àg/ mL tại các giá trị thế tích góp hấp phụ 26
Bảng 7. Cường độ dòng của Meloxicam 2 àg/ mL tại các biên độ xung. . 27
Bảng 8: Cường độ dòng Meloxicam 2 àg/ mL tại các giá trị tốc độ khuấy 28
Bảng 9. Các số liệu khảo sát ảnh hưởng của Lactose. 29
Bảng 10. Các số liệu khảo sát ảnh hưởng của Ure 31
Bảng 11: Giá trị cường độ pic đo được sử dụng để dựng đường chuẩn. 32
Bảng12: giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp. 33
Bảng 13: Hiệu suất thu hồi và RSD của MLC. . 34
Bảng14: Giá trị cường độ pic đo được khi khảo sát đường thêm chuẩn MLC trên nền
mẫu nước tiểu. . 35
Bảng15: giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp thêm chuẩn trên
nền mẫu nước tiểu. 36
Bảng 16. Giá trị độ hấp thu đo được khi khảo sát đường chuẩn . 40
Bảng 17. Số liệu độ hấp thu mẫu Mebilax 7.5 mg – Dược Hậu Giang. . 41
Bảng 18. Số liệu chiều cao pic mẫu Mebilax 7.5 mg – Dược Hậu Giang. . 41
Bảng 19. Số liệu chiều cao pic mẫu Mebilax 7.5 mg – Dược Hậu Giang thêm chuẩn. 42
Bảng 20. Số liệu chiều cao pic mẫu Meloxicam 7.5 mg – Dược Bến Tre 44
Bảng 21. Số liệu chiều cao pic mẫu Meloxicam 7.5 mg – Dược Bến Tre thêm chuẩn.45
Bảng 22. Số liệu chiều cao pic mẫu Mobimex 7.5 mg – Dược Pymepharco. 47
Bảng 23. Số liệu chiều cao pic mẫu Mobimex 7.5 mg – Dược Pymepharco thêm chuẩn. 48
Bảng 24. Số liệu chiều cao pic mẫu Mobic 7.5 mg – Đức 49
Bảng 25. Số liệu chiều cao pic mẫu Mobic 7.5 mg – Đức thêm chuẩn. . 51
Bảng 26. Số liệu chiều cao pic mẫu nước tiểu số 1 thêm chuẩn. . 52
Bảng 27. Số liệu chiều cao pic mẫu nước tiểu số 2 thêm chuẩn . 53
Bảng 28. So sánh kết quả giữa phương pháp Von – Ampe, điện cực GC và phương phổ
UV. 56



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1. Phổ đồ cho quá trình oxi hóa 2 àg / mL MLC trên điện cực GC có và không có hoạt hóa: 1- không hoạt hóa điện cực; 2 – hoạt hóa điện cực ở + 1.8 V trong 240s, thời gian hấp phụ 120s, ν = 10 mV/s 17
Hình 2. Biểu diễn sự phụ thuộc cường độ dòng của 2 àg / mL Meloxicam vào thế hoạt
hóa. . 18
Hình 3 . Biểu diễn sự phụ thuộc cường độ dòng của 2 àg/ mL Meloxicam vào thời gian
hoạt hóa 19
Hình 4. Biểu diễn sự phụ thuộc cường độ dòng của Meloxicam 2 àg / mL vào số lần
lặp lại phép đo 20
Hình 5. Phổ đồ của Meloxicam 2 àg / mL trong các dung dịch đệm khác nhau, pH 6.0
1 – Đệm B – R 0.5 M , 2- Đệm acetate 0.2 M, 3- Đệm phosphate 0.2 M 21
Hình 6. Phổ đồ của 2 àg / mL MLC trong các dung môi khác nhau: MeOH, ACN, và
DMF . 22
Hình 7. Biểu diễn sự dịch chuyển thế pic theo pH của 2 àg / mL MLC 23
Hình 8. Ảnh hưởng của nồng độ đệm Phosphate lên cường độ pic của 2 àg / mL MLC
. 24
Hình 9. Phổ đồ của 2 àg / mL MLC ở các thời gian tích góp khác nhau: 1 – tích góp
60s; 2 – tích góp 90s; 3 – tích góp 120s ;4- tích góp – 180s; 5- tích góp 240s . 25
Hình 10 . Phổ đồ của 2 àg / mL MLC ở các thế tích góp khác nhau: 1 –thế tích góp
+0.1V; 2 –thế tích góp -0.1V; 3 –thế tích góp 0.0V. . 26
Hình 11. Phổ đồ của 2 àg / mL MLC ở các biên độ xung khác nhau: 1 – biên độ 25
mV; 2 – biên độ 50mV 27
Hình 12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên cường độ pic của 2 àg /mL MLC, thế hoạt
hóa +1.8 V trong 240s, thời gian hấp phụ 120s, ν = 10 mV/s . . 28
Hình 13. Ảnh hưởng của Lactose lên cường độ pic của 2 àg /mL MLC, thế hoạt hóa
+1.8 V trong 240s, thời gian hấp phụ 120s, ν = 10 mV/s . 30
Hình 14. Ảnh hưởng của Ure trên cường độ pic MLC 2 (àg/ mL), thế hoạt hóa +1.8 V
trong 240s, thời gian hấp phụ 120s, ν = 10 mV/s . 31
Hình 15. Đường chuẩn Meloxicam, tích góp 120s; 1 – pic MLC 0.5 àg/L, 2 - pic MLC
1.0 àg/L , 3- pic MLC 1.5 àg/L, 4- pic ML 2.0 àg/L, 5- pic MLC 2.5 àg/L . 32
Hình 16. Đường chuẩn MLC, thời gian tích góp 120s, điện cực glassy carbon hoạt hóa.
Hình 17. Đường thêm chuẩn MLC trên nền mẫu Mebilax – DHG
1- nền mẫu Mebilax; 2, 3, 4, 5 – lần lượt thêm chuẩn MLC ở các nồng độ 0.3; 0.5; 1.0;
1.5 àg/mL trên nền mẫu Mebilax – DHG. 34
Hình 18. Đường thêm chuẩn MLC trên nền mẫu nước tiểu
1, 2, 3, 4, 5 – lần lượt thêm chuẩn MLC ở các nồng độ 10; 15; 20; 25; 30 àg/mL trên
nền mẫu nước tiểu . 35
Hình 19. Phổ UV của MLC 7.5mg . 39
Hình 20. Đường chuẩn MLC đo ở bước sóng 362 nm. 40
Hình 21. Phổ đồ xác định MLC trong mẫu Mebilax 7.5 mg – Dược Hậu Giang . 42
Hình 22. Phổ đồ thêm chuẩn MLC trong mẫu Mebilax 7.5 mg – Dược Hậu Giang: 1 –
mẫu Mebilax; 2- thêm chuẩn MLC 0.5 àg/mL; 3- thêm chuẩn MLC 1.0 àg/mL. . 43
Hình 23. Phổ đồ xác định MLC trong mẫu Meloxicam 7.5 mg – Dược Bến Tre 44
Hình 24. Phổ đồ thêm chuẩn MLC trong mẫu Meloxicam 7.5 mg – Dược Bến Tre: 1 –
mẫu Meloxicam- Dược Bến Tre; 2- thêm chuẩn MLC 0.5 àg/mL; 3- thêm chuẩn MLC
1.0 àg/mL. . 46
Hình 25. Phổ đồ xác định MLC trong mẫu Mobimex 7.5 mg – Dược Pymepharco. . 47
Hình 26. Phổ đồ thêm chuẩn MLC trong mẫu Mobimex 7.5 mg – Dược Pymepharco:
1 –mẫu Mobimex- Dược Pymepharco; 2- thêm chuẩn MLC 0.5 àg/mL; 3- thêm chuẩn
MLC 1.0 àg/mL. . 48
Hình 27. Phổ đồ xác định MLC trong mẫu Mobimex 7.5 mg – Dược Pymepharco. . 50
Hình 28. Phổ đồ thêm chuẩn MLC trong mẫu Mobic 7.5 mg – Đức: 1 –mẫu Mobimex-
Đức; 2- thêm chuẩn MLC 0.5 àg/mL; 3- thêm chuẩn MLC 1.0 àg/mL. 51
Hình 29. Phổ đồ thêm chuẩn 15 àg/ mL MLC trong mẫu nước tiểu số 1. . 52
Hình 30. Phổ đồ thêm chuẩn 15 àg/ mL MLC trong mẫu nước tiểu số 2. . 53
Hình 31. Phổ đồ MLC trong các mẫu dược phẩm.
1- mẫu Mebilax 7.5 mg – Dược Hậu Giang ; 2 - mẫu Meloxicam 7.5 mg – Dược Bến
Tre ; 3- Mobimex 7.5 mg – Dược Pymepharco ; 4- mẫu Mobic 7.5 mg – Đức. . 54
Hình 32. Phổ đồ MLC trong các mẫunước tiểu thêm chuẩn: 1 – mẫu nước tiểu số 1
thêm chuẩn; 2- mẫu nước tiểu số 2 thêm chuẩn 55


MỞ ĐẦU:


Meloxicam (MLC) là thuốc kháng viêm non-steroid mạnh, là dẫn xuất của oxicam của họ acid enolic. Thuốc này để chữa bệnh: viêm khớp, viêm khớp xương mãn tính, và các bệnh ở khớp. Tuy nhiên, ngoài khả năng trị liệu, Meloxicam còn có độc tính cao đối với người và động vật. Hiện nay ở nước ta, Meloxicam được xác định trong các phòng thí nghiệm có thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên lành nghề, mất nhiều thời gian và giá thành cao. Vấn đề được đặt ra là cần có một kỹ thuật phân tích đơn giản có kết quả tin cậy trong thời gian ngắn nhất với chi phí thấp nhất để xác định thuốc ở mức độ vết.

Trong các phương pháp phân tích điện hóa, phương pháp Von – Ampe được dùng rộng rãi do có các ưu điểm về độ nhạy rất cao, kỹ thuật phân tích đơn giản, độ chính xác và độ lặp lại cao; giá thành tương đối rẻ. Các loại điện cực rắn được dùng rộng rãi do hạn chế các tác động đến sức khỏe con người và môi trường sống.
Để đáp ứng nhu cầu cấp bách của xã hội, đề tài “Nghiên cứu xác định hàm lượng Meloxicam trong mẫu dược phẩm và mẫu sinh học bằng phương pháp Von – Ampe trên điện cực Glassy Carbon” được chúng tôi nghiên cứu do có những ưu thế về thiết bị, hóa chất không đắt và dễ tìm, dễ thực hiện, với thời gian phân tích tương đối nhanh, có độ chính xác và độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp và có thể thực hiện ở đa số các phòng thí nghiệm.

Hàm lượng:

- Theo Dược Điển IV VIệt Nam, viên nén MLC phải chứa C14H13N3O4S2 từ 95.0 – 105.0 % so với hàm lượng ghi trên nhãn.

Cơ chế tác động:

- Cơ chế tác động của Meloxicam giống như các thuốc kháng viêm non-steroid khác là liên quan đến sự ức chế sinh tổng hợp prostaglandin thông qua enzym cyclooxygenase.
- Meloxicam hấp thụ chậm qua đường uống với nồng độ đỉnh đạt được trong huyết tương khoảng 4 –5 giờ sau liều uống. Độ khả dụng sinh học tuyệt đối của thuốc vào khoảng 84%. Nồng độ đỉnh kế tiếp của Meloxicam xuất hiện khoảng 12 – 14 giờ sau liều cuối cùng gợi ý sự tái hấp thu của thuốc ở đường tiêu hóa. Tình trạng bền vững của thuốc đạt được trong khoảng 5 ngày.
- Viên nén Meloxicam có thể được uống vào bất cứ lúc nào, không phụ thuộc vào giờ ăn. Tỉ lệ gắn kết với protein huyết tương ở người của Meloxicam là 99,4%, chủ yếu gắn kết với albumin và tỉ lệ gắn kết là khoảng 99% ở bệnh nhân mắc bệnh thận. Nồng độ Meloxicam trong hoạt dịch sau liều uống duy nhất thay đổi từ 40 –
50% nồng độ Meloxicam trong huyết tương. Tỉ lệ thuốc ở dạng tự do trong hoạt dịch cao gấp 2,5 lần so với trong huyết tương, do trong hoạt dịch có ít albumine hơn so với huyết tương.
- Meloxicam được bài tiết qua phân và nước tiểu dưới dạng các chất chuyển hóa, chỉ có một lượng nhỏ thuốc được tìm thấy trong phân dưới dạng không đổi (1,6%) và nước tiểu (0,2%). Mức độ bài tiết của nước tiểu được xác định sau khi dùng được liều 7,5mg; 0,5%; 0,6% và 13% của liều được tìm thấy trong nước tiểu dưới dạng Meloxicam.
- Các nồng độ cao nhất được tìm thấy trong thận và gan, với mức độ tương đối thấp trong cơ xương và chất béo.
Độc tính:

* Ngoài khả năng trị liệu, MLC gây độc tính trên hệ tiêu hóa, gan, thận và tim của người và động vật.
+ Độc tính trên hệ tiêu hóa trầm trọng như chảy máu, loét và có thể gây ra thủng dạ dày, ruột non, ruột già.
+ Trên thận: gây suy thận và viêm kẽ thận. Gây giữ nước và phù nên được sử dụng thận trọng ở những bệnh nhân bị ứ nước, cao huyết áp, hay suy tim.
+ Tổng phân tích các nghiên cứu lâm sàng đã công bố cho thấy làm tăng huyết áp trung bình lên 5 mmHg → gây nguy hiểm với bệnh nhân cao huyết áp.
+ Khi dùng quá liều sẽ có các hiện tượng sau: hôn mê, chóng mặt, buồn nôn, nôn và đau thượng vị, nói chung những triệu chứng này sẽ nhanh chóng hồi phục với các biện pháp điều trị hỗ trợ. Xuất huyết tiêu hóa có thể xảy ra. Trường hợp ngộ độc nặng có thể làm cao huyết áp, suy thận cấp, suy gan, suy hô hấp, hôn mê, co giật, suy tim mạch, ngừng tim, phản ứng phản vệ đã được báo cáo khi sử dụng các thuốc kháng viêm non-steroid có thể xảy ra sau khi sử dụng thuốc quá liều.
Mục đích của việc xác định MLC:

- MLC là một loại biệt dược chữa bệnh nên việc xác định hàm lượng chính xác rất cần thiết để người sử dụng dùng được thuốc đảm bảo chất lượng và đạt hiệu quả sử dụng cao.
- Tuy nhiên, MLC lại gây độc với một số cơ quan trong cơ thể như: hệ tiêu hóa, gan, thận và tim, vì thế cần xác định lượng tồn dư MLC trong cơ thể qua nước tiểu.