MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái. Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh. Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững. Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè. - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng. 3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên. - Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. * Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV kiểm định. 2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ các mẫu đất khác nhau. 3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn. MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn .5 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 6 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI . .8 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy .8 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 9 1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .10 1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 10 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11 1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN .12 1.3.1. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh .12 1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 15 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16 1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18 1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm 18 1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật .21 Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất .24 2.1.1. Nguyên liệu 24 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .24 2.2. Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè .27 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 28 2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh 28 2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29 2.2.3. Bảo quản giống 29 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 30 2.2.4.1. Đặc điểm hình thái .30 2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy 31 2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31 2.2.5. Lên men tạo kháng sinh .32 2.2.5.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp .32 2.2.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 33 2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 33 2.2.6. Các phương pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 33 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB .33 2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR .34 2.2.6.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 35 2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu .36 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè 37 3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn .38 3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 38 3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2 42 3.3.1. Đặc điểm hình thái 42 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy . .43 3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .45 * Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon .45 * Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp .46 * Khả năng chịu muối .46 * Khả năng sinh enzym ngoại bào 47 3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 48 3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 50 3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn .52 3.4.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp .52 3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .54 3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 56 3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử 57 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn 57 3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 58 Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận .60 4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo .61 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 .
