Thạc Sĩ Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptom yces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở T

1. Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU


Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Mưa là đ iều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái.
Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh.
Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên. Chúng tô i thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptom yces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên”.


2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè.
- Nghiên cứu một số đặc điểm s inh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng.
3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

* Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất

Thái Nguyên.

- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên.

* Nội dung nghiên cứu

1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV

kiểm đ ịnh.

2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ các mẫu đất khác nhau.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm s inh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuô i cấy đến khả năng tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn.


MỤC LỤC


Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục
Những chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Trang


MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3

1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4

1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn .5

1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 6

1.2. CÁC PHưƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI . .8

1.2. 1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy .8

1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 9

1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .10

1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 10

1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11

1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN .12

1.3.1. Lược sử nghiên cứu chất kháng s inh .12

1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 15

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng s inh 16

1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA

CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18

1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm 18

1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật .21

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và hóa chất .24

2.1.1. Nguyên liệu 24

2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .24

2.2. Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè .27

2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 28

2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28

2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng s inh 28

2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29

2.2.3. Bảo quản giống 29

2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 30

2.2.4.1. Đặc điểm hình thái .30

2.2.4.2. Đặc điểm nuô i cấy 31

2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31

2.2.5. Lên men tạo kháng sinh . 32

2.2.5.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp .32

2.2.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 33

2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 33

2.2.6. Các phương pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 33

2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB .33

2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR .34

2.2.6.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 35

2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu .36

Chươ ng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè 37

3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn .38

3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 38

3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41

3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2 42

3.3.1. Đặc điểm hình thái 42

3.3.2.Đặc điểm nuô i cấy . .43

3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .45

* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon .45

* Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp .46

* Khả năng chịu muố i .46

* Khả năng sinh enzym ngoại bào 47

3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 48

3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 50

3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn .52

3.4.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp .52

3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .54

3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 56

3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử 57

3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn 57

3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 58

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận . 60

4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo .61

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN



XK : Xạ khuẩn

VSV : Vi s inh vật

CKS : Chất kháng s inh HSCC : Hệ sợi cơ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh KTKS : Khuẩn ty khí sinh
HTKS : Hoạt tính kháng sinh HTKN : Hoạt tính kháng nấm MT : Mô i trường
KHVQH : Kính hiển vi quang học KHVĐT : Kính hiển vi điện tử DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid
ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat
TAE : Tris - Acetate - Ethylend iamin tetracetic acid

PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang


Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm .37

Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39

Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè .40

Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn 41

Bảng 3.5. Đặc điểm nuô i cấy của chủng R2 và Đ1 .44

Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 45

Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1 .46

Bảng 3.8. Khả năng chịu muố i của 2 chủng R2 và Đ1 .47

Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm

kiểm đ ịnh .48

Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis 50

Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52

Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi tr ường

lên men khác nhau .53

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS

của 2 chủng R2 và Đ1 .55

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng s inh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 .56

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang


Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh .38

Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu .39

Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm .40

Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn .42

Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2 42

Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1 .43

Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng .44

Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn .47

Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2 49

Hình 3.10: Ảnh hưởng của mô i trường đến khả năng tổng hợp CKS 54

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS .55

Hình 3.12 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS .57

Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn .58

Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu .59