MỞ ĐẦU Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C trong DNA cao hơn 55%, phân bố rộng rãi trong đất, có vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Xạ khuẩn được các nhà khoa học cũng như các nhà vi sinh công nghiệp quan tâm do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp hữu ích cho con người, đặc biệt là các kháng sinh. Nhiều kháng sinh hiện đang được sử dụng có nguồn gốc từ xạ khuẩn, đặc biệt là từ Streptomyces. Mặc dù vậy, việc tìm ra các kháng sinh mới phục vụ cho nhu cầu điều trị đang trở nên cấp thiết do tính kháng thuốc ngày càng trở nên phổ biến ở vi khuẩn gây bệnh. Trong những năm gần đây việc tìm ra kháng sinh mới từ Streptomyces ngày càng trở nên hiếm và khó khăn, do vậy, việc phân lập các loại xạ khuẩn khác để tìm kháng sinh mới ngày càng trở nên cần thiết trong chương trình sàng lọc kháng sinh công nghiệp. Trong xu hướng này, loài xạ khuẩn hiếm Streptosporangium được quan tâm do đặc tính sản sinh các hợp chất thứ cấp có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như kháng sinh, hợp chất kháng ung thư, kháng khối u, bảo vệ thực vật nhưng chưa được nghiên cứu rộng rãi. Trong mục tiêu chung nhằm phát hiện và phát triển các sản phẩm có hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người, bảo vệ cây trồng từ tài nguyên vi sinh vật Việt Nam của Trung tâm nghiên cứu hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học (RCBNP) thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, luận văn này tập trung vào một số nội dung sau đây: - Phân lập, định danh xạ khuẩn hiếm Streptosporangium từ Vườn quốc gia Cát Tiên. - Khảo sát đặc điểm nuôi cấy của các chủng phân lập. - Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của một số chủng phân lập. MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 01 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 02 1.1. Đặc điểm .03 1.1.1. Phân loại 03 1.1.2. Đặc điểm sinh thái .03 1.1.3. Đặc điểm bộ gen và tính bất ổn định về di truyền .04 1.1.4. Hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở xạ khuẩn 06 1.2. Xạ khuẩn Streptosporangium .08 1.2.1. Đặc điểm phân loại 08 1.2.2. Đặc điểm chung 14 1.2.3. Sự hình thành bào tử ở Streptosporangium .14 1.2.4. Đặc điểm sinh thái 15 1.2.5. Hợp chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học từ Streptosporangium 15 1.2.6. Lý do chọn Streptosporangium làm đối tượng nghiên cứu của đề tài 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .18 2.1. Vật liệu .19 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ .19 2.1.2. Hoá chất 20 2.1.3. Môi trường 24 2.1.4. Vật liệu sinh học .28 2.1.5. Địa điểm tiến hành thí nghiệm 30 2.2. Phương pháp .30 2.2.1. Thu và chuẩn bị mẫu đất 30 2.2.2. Xác định hàm lượng hữu cơ .31 2.2.3. Phương pháp phân lập xạ khuẩn Streptosporangium .31 2.2.4. Làm tiêu bản mẫu và chụp hình dưới kính hiển vi 32 2.2.5. Thử nghiệm khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn Streptosporangium phân lập 33 2.2.6. Tách chiết bộ gen xạ khuẩn .35 2.2.7. Thu nhận gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR .36 2.2.8. Tạo dòng sản phẩm PCR của bộ gen 16S rRNA .37 2.2.9. Giải trình tự gen 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh loài 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .41 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn Streptosporangium từ mẫu đất Vườn quốc gia Cát Tiên .42 3.2. Đặc điểm hình thái thô đại và hiển vi điển hình của Streptosporangium của các chủng phân lập Streptosporangium dự tuyển .44 3.3. Đặc điểm phân bố của xạ khuẩn Streptosporangium phân lập được tại Vườn quốc gia Cát Tiên 55 3.4. Đặc điểm tăng trưởng và hình thái của các chủng Streptosporangium dự tuyển trên các môi trường thạch khác nhau 56 3.5. Nuôi cấy và thử nghiệm khả năng tạo kháng sinh của các chủng xạ khuẩn trên môi trường lỏng 60 3.5.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh từ dịch nuôi cấy 60 3.5.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh của dịch chiết xuất xạ khuẩn .61 3.6. Thu nhận và tạo dòng gen 16S rRNA của các chủng Streptosporangium phân lập 68 3.7. Giải trình tự gen 16S rRNA và định danh các chủng Streptosporangium 70 3.7.1. Trường hợp chủng CAT-1.20 70 3.7.2. Trường hợp chủng CAT-1.21 .72 3.7.3. Trường hợp chủng CAT-1.22 .74 3.7.4. Trường hợp chủng CAT-7.32 76 3.7.5. Trường hợp chủng CAT-23.25 .78 3.7.6. Trường hợp chủng CAT-23.26 .80 3.7.7. Trường hợp chủng CAT-56.54 82 3.7.8. Trường hợp chủng CAT-58.56 .84 3.7.9. Trường hợp chủng CAT-63.46 .86 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .89 4.1. Kết luận .90 4.2. Đề nghị .90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 PHỤ LỤC KẾT QUẢ i
