Luận Văn Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc

TÓM TẮT ​

Đề tài: "NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC" được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 đến ngày 30 tháng 8 năm 2007 tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Hiện nay, cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới (Cuba, Ấn Độ, Australia); vì vậy, diện tích trồng mía cũng như sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở cây mía có đến 126 loại bệnh xảy ra làm giảm đáng kể đến năng suất và sản lượng của cây, gây thiệt hại to lớn đối với ngành công nghiệp đường trên thế giới (Ricaud và ctv., 1989). Trong đó, bệnh cằn mía gốc được phát hiện ở hầu hết các khu vực trồng mía, có thể làm giảm đến 50 % sản lượng đối với các giống nhạy cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995). Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), tác nhân gây bệnh cằn mía gốc. Đây là một loại vi khuẩn có kích thước nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 àm, đôi khi dài đến 10 m), dạng conryne, kí sinh chuyên tính gây tắc bó mạch của cây, làm giảm sức sống và số lượng chồi tạo thành, đặc biệt là các chồi hình thành sau khi thu hoạch. Cây bị bệnh này thường còi cọc, đường kính cũng như chiều dài thân nhỏ hơn so với cây bình thường (Davis và ctv., 1980). Mục đích của đề tài nhằm khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx trong bó mạch dọc theo vị trí lóng và khảo sát thời gian kí sinh gây tắc mạch của vi khuẩn khi xâm nhập vào cây; phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh; sau đó tiến hành các thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định Lxx từ các dòng vi khuẩn được phân lập. Các thí nghiệm khảo sát trên nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR, dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh), từ đó đưa ra chiến lược xử lý và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các nội dung thực hiện
(1) Khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo các lóng bằng phương pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method). (2) Chủng bệnh các cây nuôi cấy
mô 3 tháng tuổi bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx. Sau đó, khảo sát thời gian vi khuẩn gây tắc mạch và tỉ lệ cây được chủng bị nhiễm. (3) Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh và thực hiện các phản ứng sinh hóa nhằm xác định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được. Các kết quả thu được (1) Kết quả cho thấy hầu hết mía được khảo sát đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc với tỉ lệ nhiễm khác nhau từ nhẹ đến trung bình. Vi khuẩn Lxx tập trung chủ yếu ở lóng thứ nhất từ dưới lên và có mật độ giảm dần trong các lóng ở phía trên. (2) Hầu hết các cây nuôi cấy mô sau khi chủng đều bị nhiễm bệnh. Kết quả khảo sát cho thấy cây bắt đầu bị tắc mạch sau khoảng 30 ngày chủng bệnh, tỉ lệ mạch tắc tăng dần theo thời gian quan sát (45, 60 ngày). (3) Các dòng khuẩn lạc phân lập được sau 28 – 42 ngày nuôi cấy đều có dạng tròn lồi, đường kính 0,1 – 0,3 mm, trong suốt giống như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx. Các khuẩn lạc này được cấy chuyền trên môi trường MSC và SC, sau đó tăng sinh trong môi trường lỏng S8 và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên, kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy chỉ có một dòng vi khuẩn phân lập được có thể là Leifsonia xyli subsp. xyli. Giới hạn của đề tài (1) Phương pháp nhuộm STM là một phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc. Tuy nhiên, phương pháp này không thể tiến hành ở giai đoạn sớm mà chỉ có thể tiến hành đối với những cây mía trên 3 tháng tuổi; do đó, việc kiểm soát bệnh ở giai đoạn cây còn nhỏ rất khó khăn. (2) Quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx rất khó khăn do đây là vi khuẩn ký sinh chuyên tính trong bó mạch của cây mía. Vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian 28 – 42 ngày, do môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. (3) Kết quả thử nghiệm sinh hóa chỉ nhằm phát hiện sơ bộ vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được, cần phải tiến hành các thử nghiệm phân tử để xác định lại kết quả đã đạt được.

1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu 3
1.2.1. Mục đích 3
1.2.2. Nội dung 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía 4
2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển 4
2.1.2. Phân loại học 4
2.1.3. Phân bố 5
2.1.4. Đặc điểm thực vật học 5
2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía 5
2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển 6
2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía 8
2.2. Các loại bệnh hại trên mía 9
2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc 12
2.3.1. Tác nhân gây bệnh 12
2.3.2. Triệu chứng 13
2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh 14
2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh
2.4. Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Lxx
2.4.1. Phương pháp chẩn đoán truyền thống 16
2.4.2. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi 16
2.4.3. Phương pháp nhuộm STM 16
2.4.4. Phương pháp huyết thanh học 17
2.4.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử 18
2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc 19
2.5.1. Trên thế giới 19
2.5.2. Trong nước 20
3. VẬT LIỆU PHưƠNG PHÁP 21
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21
3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm 21
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm 21
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 21
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ 22
3.3. Phương pháp nghiên cứu 22
3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu 22
3.3.2. Phương pháp nhuộm STM 24
3.3.3. Phương pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh 24
3.3.4. Phương pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được
3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn 24
3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate 26
3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật 26
3.4. Bố trí thí nghiệm 27
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh 29
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng 34
4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx 38
4.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được 41
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45
5.1. Kết luận 45
5.2. Đề nghị 45
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 47
Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 48
Tài liệu tham khảo Internet 51
7. PHỤ LỤC 52
Phụ lục 1: Môi trường SC 52
Phụ lục 2: Môi trường MSC 52
Phụ lục 3: Môi trường lỏng S853
Phụ lục 4: Môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth 53
Phụ lục 5: Môi trường Starch 53
Phụ Lục 6: Bảng sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx 54