Luận Văn Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc

Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra. Đây là
bệnh có tác động nguy hiểm nhất đến sản lượng mía trên thế giới. Bệnh có thể gây
thiệt hại từ 5 – 15 % sản lượng (Comstock, 2005) và mức tổn thất có thể lên đến 50
% đối với vụ mía gốc (Davis, 1980). Vi khuẩn Lxx không gây ra các triệu chứng
bên ngoài đặc trưng, hơn nữa sự lan truyền vi khuẩn lại diễn ra rất nhanh trong các
ruộng mía làm cho thiệt hại do bệnh gây ra càng nặng nề hơn. Nhìn chung, cây bị
nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng độ tuổi nên người nông
dân thường lầm tưởng các triệu chứng của bệnh là do điều kiện canh tác (cây bị
thiếu chất dinh dưỡng, đất trồng thiếu độ ẩm).
Lxx kí sinh chuyên tính trong bó mạch nên việc nghiên cứu loại vi khuẩn này
rất khó khăn. Trên thế giới, vi khuẩn Lxx mới được quan tâm nghiên cứu trong thời
gian gần đây. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã đạt được một số thành
công nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc như: phân lập thành công
vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh (Davis, 1980); thiết lập quy trình phát
hiện Lxx trong dịch chiết và dịch khuẩn lạc bằng kĩ thuật PCR (Y Pan và ctv.,
1998); giải mã trình tự bộ gen của Lxx (Luis và ctv., 2004).
Ở nước ta, bệnh cằn mía gốc là một loại bệnh đã được phát hiện từ lâu, trong
lịch sử cũng đã có nhiều vùng bị thiệt hại nặng nề do bệnh gây ra (Hà Đình Tuấn,
2004). Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh này
cũng như vi khuẩn Lxx; người nông dân thậm chí không biết ruộng mía của mình bị
bệnh, sản lượng thu hoạch mía giảm đáng kể làm cho công suất của các nhà máy
đường trong nước chỉ còn 50 – 60 % (Hà Đình Tuấn, 2004).
Để phòng tránh được những thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và phẩm chất
mía do bệnh gây ra, cần phải đề ra những biện pháp kiểm soát và quản lý bệnh một
cách hiệu quả. Do đó, việc phát hiện sớm vi khuẩn Lxx trên cây mía là một yêu cầu
cấp thiết trong công tác tuyển chọn và kiểm định giống nhằm tạo ra một nền nông
nghiệp ổn định, hiệu quả, trực tiếp thúc đẩy ngành công nghiệp mía đường phát
triển, đáp ứng đủ nhu cầu trong nước và xuất khẩu.
Do sự thiệt hại về sản lượng đã ra gây tổn thất đáng kể cho ngành công nghiệp
mía đường cũng như tính cấp thiết của việc nghiên cứu, chúng tôi đã thực hiện đề
tài: "Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây
bệnh cằn mía gốc" nhằm tìm hiểu kĩ lưỡng hơn về tác nhân gây bệnh. Từ đó, đưa
ra được một phương pháp phát hiện vi khuẩn nhanh chóng và chính xác, góp phần
vào chiến lược kiểm soát và hạn chế bệnh.
1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
Thực hiện các nghiên cứu cơ bản về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Leifsonia
xyli subsp. xyli để tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR,
dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía (Saccharum spp.)
2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển

2.1.3. Phân bố
Hiện nay, cây mía là cây trồng chính ở nhiều nước nhiệt đới trên thế giới. Nơi
có vĩ độ cao nhất mà cây mía được trồng là Natal, Argentina, cực nam của Australia
(khoảng 30 độ S), phía tây nam Pakistan (khoảng 34 độ N) và phía nam Tây Ban
Nha (37 độ N) (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006).
2.1.4. Đặc điểm thực vật học
2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía
Rễ mía: cây mía có hai loại rễ là rễ sơ sinh và rễ
thứ sinh. Rễ sơ sinh (rễ hom) mọc ra từ đai rễ của
hom trồng; loại rễ này có nhiệm vụ bám đất, hút nước,
cung cấp chất dinh dưỡng cho sự nảy mầm ở thời kì
đầu sinh trưởng. Khi mầm mía chuyển thành cây con,
các rễ thứ sinh mọc ra từ đai rễ của cây con tự hút
nước và chất dinh dưỡng để cung cấp cho cây, các rễ
sơ sinh sẽ teo dần và biến mất.
Thân mía: được hình thành bởi nhiều lóng mía
hợp lại, có màu sắc và hình dạng khác nhau. Thân mía
không chỉ là nơi để giữ bộ lá mà còn có nhiệm vụ dẫn nước, chất dinh dưỡng từ rễ
tới lá và dự trữ đường nhờ quá trình quang hợp ở bộ lá. Thân mía là đối tượng thu
hoạch và là nguyên liệu chính để chế biến đường ăn.
Lá: gồm có bẹ lá và phiến lá. Bẹ lá là phần bao bọc thân mía, bảo vệ mắt
mầm; phiến lá có hình lưỡi mác (màu xanh hoặc màu xanh thẩm), có một gân giữa
màu sáng và hình dáng, kích thước khác nhau tùy giống. Lá là tổ chức đồng hóa
thực sự của cây, lá có nhiệm vụ hô hấp và thực hiện quá trình quang hợp.
Hoa (bông cờ): hoa mía có tổ chức sinh sản ngầm với cấu trúc đơn giản. Mỗi
hoa bao gồm cả tính đực và tính cái với ba nhị, một bầu noãn và hai nhụy. Khi hoa
mía nở, các bao phấn của nhị tung phấn, nhờ gió mà nhụy cái dễ dàng tiếp nhận hạt
phấn. Ở cây mía, có giống ra hoa, có giống không ra hoa, có giống ra hoa sớm, có
giống ra hoa muộn, . đó là kết quả sinh lý tự nhiên của cây trồng nói chung và cây
mía nói riêng. Tuy nhiên, trong sản xuất người ta không thích mía ra hoa.
Hạt mía: là vật liệu sinh sản hữu tính của cây mía, đây là kết quả cuối cùng
của giai đoạn sinh thực. Hạt mía giống một chiếc vảy nhỏ, hình thoi và nhẵn, độ dài
1 - 1,25 mm, nặng 0,15 - 0,25 mg. Hạt mía chỉ có ý nghĩa trong lai tạo tuyển chọn
giống mía (Nguyễn Huy Ước, 1999; Trần Thùy, 1996).

2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển
Theo Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996), chu kì sinh trưởng của cây mía trong một
vụ thường kéo dài 1 năm (trường hợp đặc biệt như ở Hawai là 2 năm). Nhưng chu
kì khai thác của 1 ruộng mía có thể kéo dài từ 3 - 10 năm tùy vào điều kiện từng
vùng. Dù là mía tơ hay mía gốc, chu kì sinh trưởng của cây mía gồm 5 thời kì:
Thời kì nảy mầm: thời kì nảy mầm tính từ khi đặt hom trồng cho tới lúc mầm
mía nảy thành cây con, mở đầu cho hoạt động sống của cây mía. Hom mía từ trạng
thái ngủ chuyển sang trạng thái hoạt động trải qua một loạt biến đổi sinh hóa phức
tạp. Trong quá trình nảy mầm, hom mía hô hấp mạnh. Dưới tác dụng của enzyme,
đường saccharose và protein được phân giải thành glucose và acid amine cung cấp
cho hoạt động sống của mầm, rễ. Nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự nảy mầm là
đường glucose và acid amine, do đó hàm lượng các chất này trong hom mía nhiều
hay ít có quan hệ trực tiếp đến tốc độ nảy mầm. Giữa hàm lượng đường glucose và
số ngày cần thiết cho sự nảy mầm có tương quan nghịch, hàm lượng đạm tan trong
hom mía tương quan thuận với tỉ lệ nảy mầm.
Thời kì cây con: bắt đầu từ khi cây có lá thật thứ nhất cho đến khi phần lớn
cây trong ruộng mía có 5 lá thật. Rễ cây bắt đầu phát triển khi cây con có hai lá thật,
như vậy trong suốt thời gian đầu cây con sống một phần dựa vào rễ hom. Sau khi rễ
cây đã phát triển mạnh thì nhiệm vụ cung cấp dinh dưỡng chính do rễ cây đảm
nhiệm. Do đó, trong thời kì này, phải tạo điều kiện cho lá sinh trưởng mạnh để cây
quang hợp tốt, đồng thời thúc đẩy rễ cây phát triển nhanh.
Thời kì đẻ nhánh (nhảy bụi hoặc đâm chồi): đẻ nhánh thực chất là sự nảy
mầm của những mầm ở phần gốc của cây. Khi cây mía có từ 6 - 7 lá thật, các mầm
nằm ở dưới mặt đất nảy thành nhánh. Từ thân mẹ đẻ ra nhánh cấp 1, nhánh cấp 1 đẻ
ra nhánh cấp 2 và tiếp tục thành một bụi mía. Thời gian đẻ nhánh thường kéo dài từ
3 - 4 tháng tùy thuộc giống mía, thời vụ trồng, kĩ thuật chăm sóc.
Thời kì vươn cao (vươn lóng): trong thời kì này, thân vươn cao nhanh, đường
kính thân tăng mạnh, rễ, ngọn phát triển, số lá tăng thêm và đổi mới không ngừng.
Trong các thời kì trước, mía sinh trưởng chậm vì quá trình quang hợp ở lá và sự hấp
thụ ở rễ còn yếu, sản phẩm quang hợp tạo ra có hạn và một phần quan trọng phải
dùng để tạo nên thân, lá, rễ. Trong thời kì vươn cao, trên cơ sở bộ lá và bộ rễ đã
phát triển hoàn chỉnh, các quá trình sinh lý của cây đạt tới đỉnh cao, hiệu lực sử
dụng độ phì đất đai, phân bón, năng lượng ánh sáng mặt trời tăng lên. Trong thời kì
này mía sinh trưởng nhanh, tốc độ tăng trưởng chiều cao đạt từ 10 cm/tháng đến 50
cm/tháng. Do đó, thời kì vươn cao là thời kì quyết định trọng lượng thân, tức là thời
kì quyết định năng suất mía cây.
Thời kì chín công nghiệp và trổ cờ: vào cuối thời kì vươn lóng, nhiệt độ và
lượng mưa giảm dần (ở nước ta thường là từ tháng 11 trở đi), cây mía sinh trưởng
chậm lại và bước vào thời kì tích lũy đường mạnh mẽ. Sự hình thành và tích lũy
đường trong cây mía bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn một là sự kết hợp của CO2 và
H2O thành đường đơn glucose với sự có mặt của diệp lục và ánh sáng. Giai đoạn hai
là quá trình chuyển hóa đường đơn thành đường saccharose và các đường đa khác,
giai đoạn này không cần ánh sáng và diệp lục. Các bộ phận của cây mía như thân, lá
đều có thể tổng hợp đường mía từ đường đơn. Đường mía tổng hợp từ lá chuyển
vào thân, một phần dùng cho hô hấp và cấu tạo thân, lá, rễ; phần còn lại tích lũy
trong thân dưới dạng saccharose.
Chín công nghiệp là khi hàm lượng đường trong cây mía đạt mức thích hợp để
thu hoạch ép đường. Lúc cây mía đang sinh trưởng hàm lượng đường glucose trong
cây thấp, khi cây sinh trưởng chậm lại phần lớn các sản phẩm đồng hóa do bộ lá tạo
thành chuyển sang dạng đường tích lũy trong thân, hàm lượng đường trong cây tăng
lên nhanh chóng. Quá trình tích lũy đường trong cây mía diễn ra từ dưới lên trên,
lần lượt lóng này đến lóng khác, lóng dưới chín trước lóng trên. Lúc mía sắp chín,
tốc độ tăng hàm lượng đường ở những lóng trên nhanh hơn lóng dưới; do đó, hàm
lượng đường trong ngọn "đuổi kịp" gốc cho đến lúc bằng nhau. Khi hàm lượng
đường của phần thân ngọn tương đương phần thân gốc là đúng độ chín công nghiệp.
Trổ cờ là thời kì chín sinh học của cây mía. Ở nước ta, mía thường trổ cờ từ
tháng 10 (miền Nam) đến tháng 12 (miền Bắc). Trổ cờ thường không trùng với thời
kì chín công nghiệp và có ảnh hưởng không tốt đến nguyên liệu mía cây phục vụ
cho nhà máy đường. Khi mía trổ cờ, thân ngừng sinh trưởng, tỉ lệ đường giảm, tỉ lệ
xơ tăng. Vì vậy, trong sản xuất mía thường tìm cách hạn chế sự ra hoa kết hạt.

2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía
Mía là nguyên liệu chủ yếu để sản xuất đường. Đường là loại thực phẩm cần
thiết trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều dân tộc trên thế giới. Trong cơ thể
con người, đường mía được chuyển hóa thành glucose và fructose, các loại đường
tham gia vào quá trình oxy hóa để tạo năng lượng cho cơ thể hoạt động. Trung bình
1 kg đường cung cấp năng lượng tương đương 0,5 kg mỡ hoặc 50 - 60 kg rau quả.
Ngoài sản phẩm chính là đường, những phụ phẩm của cây mía gồm:
Bã mía: chiếm 25 - 30 % trọng lượng mía đem ép. Bã mía chứa trung bình 49
% nước, 48,5 % xơ, 2,5 % chất hòa tan (đường). Bã mía có thể dùng ngay làm
nhiên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc. Cao hơn nữa,
từ bã mía có thể làm ra furfural là nguyên liệu của ngành sợi tổng hợp.
Mật gỉ: chiếm 3 - 5 % trọng lượng mía đem ép. Thành phần mật gỉ gồm nước
(10 %), đường saccharose (35 %), đường khử (20 %), tro (15 %). Mật gỉ là nguyên
liệu để chưng cất sản xuất rượu Rhums và cồn công nghiệp (từ 1 tấn mật gỉ có thể
sản xuất được 300 lít cồn tinh và 3800 lít rượu). Ngoài ra, mật gỉ còn được sử dụng
để sản xuất các loại men và các loại acid (acid acetic, acid citric).
Bùn lọc: chiếm 1,5 – 3 % trọng lượng mía đem ép, là sản phẩm cặn bã còn lại
sau khi chế biến đường. Bùn lọc chứa 0,5 % N, 1,6 % P2O5, 0,4 % K2O, 3 % protein
thô và một lượng lớn chất hữu cơ. Từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía để sản xuất nhựa
xerezin làm sơn, xi đánh giày, bản sáp roneo. Sau khi lấy sáp, bùn lọc được tận
dụng làm phân bón.
Về phương diện nông học, mía là loại cây trồng có khả năng thích ứng mạnh,
có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, cho phép tận dụng, cải tạo những vùng
đất khó khăn. Tóm lại, mía là cây trồng có khả năng cho sinh khối lớn, lại có khả
năng tái sinh mạnh (trồng một năm thu hoạch được nhiều năm) nên có hiệu quả
kinh tế cao (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996).

2.2. Các loại bệnh hại trên cây mía
Theo Nguyễn Huy Ước (1994), mía là loại cây trồng một lần nhưng lại có khả
năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi
cho nhiều loài sâu bệnh tồn tại và phát triển. Hơn nữa, khi cơ cấu giống mía phong
phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh ngày
càng đa dạng hơn. Từ năm 1989 đến nay, thành phần bệnh hại mía trên thế giới và
các tác nhân gây bệnh chưa có gì thay đổi với 126 bệnh gồm: 9 bệnh do virus, 2
bệnh do phytoplasma, 9 bệnh do vi khuẩn, 68 bệnh do nấm, 3 bệnh do thực vật kí
sinh, 2 bệnh do tác động cơ giới và 24 bệnh chưa xác định được nguyên nhân
(Joaquin, 2001) (Trích dẫn bởi Hà Đình Tuấn, 2004). Ở Việt Nam, tình hình nghiên
cứu và khảo sát bệnh trên cây mía không nhiều. Theo kết quả nghiên cứu của Hà
Đình Tuấn (2004) cho thấy vùng nguyên liệu mía Đông Nam Bộ có 3 bệnh do
virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chưa
biết tác nhân và một số bệnh khác do tuyến trùng, thực vật kí sinh, do yếu tố môi
trường và dinh dưỡng gây ra. Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến
được trình bày ở bảng 2.1

Tên Việt Nam Tên tiếng Anh Tác nhân gây hại
I Bệnh do nấm
1 Bệnh sọc nâu Brown stripe Cohliobalus stenospilus Drechs
2 Bệnh mốc sương Downy mildew Peronosclerospora sacchri T. Miyake
3 Bệnh đốm mắt én Eye spot Bipolaris sacchari shoemaker
4 Bệnh đốm trắng White speck Bipolaris sacchari T.C.Lo
5 Bệnh cháy lá Leaf scorch Stagonospora sacchari Lo and Ling
6 Bệnh dứa Pinapple disease Ceratosystis paradoxa Moreau
7 Bệnh xoắn cổ lá Pokkah boeng Fusarium moniliform Sheldon
8 Bệnh thối đỏ Red rod Colectotrichum falcatum Went
9 Bệnh rỉ sắt đỏ Rust Puccinia melanopcephala H. & P. Syd
10 Bệnh rỉ sắt vàng Rust orange P. kuehnii Butl
11 Bệnh than Smut Ustilago senaminea Syd
12 Bệnh đốm vàng Yellow spot Mycovellosiella koepket
13 Bệnh đốm vòng Ring spot Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan
II Bệnh do vi khuẩn
14 Bệnh gôm Gumming diease Xanthomonas camestris pv. Vasculorum
15 Bệnh thân ngọn đâm chồi
Leaf scald Xanthomonas alibilineans
16 Bệnh cằn mía gốc
Ratoon stunting
disease
Leifsonia xyli subsp. xyli
17 Bệnh sọc đỏ Red stripe Pseudomonas rubrilineans
III Bệnh do Phytoplasma
18 Bệnh chồi cỏ Grassy shoot Chưa rõ
19 Bệnh trắng lá White leaf Chưa rõ
VI Bệnh do virus
20 Bệnh sọc vàng Chlorotic streak Chưa rõ
21 Bệnh Fiji Fiji disease Fiji disease virus
22 Bệnh khảm Mosaic Sugarcane mosaic virus
23 Bệnh đốm sọc Streak Sugarcane streak virus
24 Bệnh vàng gân lá Yellow leaf disease Sugarcane yellow leaf virus

2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc
2.3.1. Tác nhân gây bệnh
Bệnh cằn mía gốc xảy ra ở hầu hết các khu vực trồng mía trên thế giới:

Vi khuẩn Lxx có dạng thẳng hay gậy mảnh nhưng một vài tế bào lại căng
phình ra ở ngoại biên hay ở giữa tế bào, sinh sản theo hình thức nhân đôi (hình 2.3).
Mesosome thường hiện diện và thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn
(hình 2.4). Cho đến nay, người ta nhận thấy cây mía là kí chủ tự nhiên duy nhất của
Lxx, loại vi khuẩn này kí sinh chuyên tính trên cây mía nhưng không tạo ra các triệu
chứng bệnh đặc trưng (Davis và Bailey, 2000).

2.3.2. Triệu chứng
Thông thường, triệu chứng cằn cỗi và khả năng mọc chồi kém được cho là
hậu quả của sự tắc mạch. Tuy nhiên, Leifsonia xyli subsp. xyli không tạo ra các
triệu chứng bên trong hoặc bên ngoài đáng tin cậy (Brumbley và ctv., 2006). Triệu
chứng nghi ngờ là cây bị cằn cỗi, thấp, đường kính nhỏ, lóng ngắn, số lượng cây
(bụi) ít hơn bình thường. Trong các vụ gốc, cây bệnh sinh trưởng chậm và có thể
chết đối với các giống mẫn cảm cao. Ở các giống mẫn cảm cao, cây bị rũ xuống
Hình 2.4. Sự phân chia của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli được
phân lập từ dịch chiết nước mía (Nguồn: Brumbley và ctv., 2006)
Chú thích: Có 4 mesosome rõ ràng (3 trong tế bào dài và 1 trong tế bào ngắn).
Đường kính của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli đo được là 195 - 220 nm, chiều
dài của hai tế bào gắn với nhau là 2610 nm. Tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli không
xuyên qua màng lọc 0,22 m nhưng có thể xuyên qua màng lọc 0,4 m. Các vi khuẩn
hình que này có thể phồng ra ở một đầu làm cho chúng có dạng hình chùy.
trong điều kiện thiếu ẩm độ, bị thối ở đỉnh và mép lá. Hệ thống rễ của cây bị bệnh
phát triển kém hơn so với cây khỏe mạnh bình thường.
Bệnh gây ra làm cho các bó mạch ở phía dưới đốt mía bị đổi màu, nhưng triệu
chứng này thường chỉ xuất hiện trong thời gian rất ngắn. Khi chẻ dọc thân mía của
cây bị bệnh có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn và sự đổi
màu này không kéo dài khắp lóng mía như triệu chứng của các bệnh khác (Davis và
Bailey, 2000) (Hình 2.5). Ở một số giống, cây mía non cũng có sự đổi màu từ vàng
đến nâu đỏ của tế bào mạch dẫn ngay dưới mô phân sinh ngọn; triệu chứng có thể
có là làm cho 1 phần thân bị chuyển thành màu hồng ngay tại các đỉnh sinh trưởng
của chồi non hay hóa đỏ cam tại các bó mạch ở giữa đốt của những thân mía đã
trưởng thành (Brumbley và ctv., 2006).

2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh
Vi khuẩn Lxx kí sinh chuyên tính trong cây mía và không có môi giới lan
truyền bệnh; bệnh lây nhiễm trong cánh đồng do sử dụng hom giống đã bị nhiễm
bệnh. Bởi vì triệu chứng của bệnh không thể quan sát được bằng mắt nên vi khuẩn
có thể lan truyền từ vùng này sang vùng khác một cách "âm thầm" mà người nông
dân vẫn không biết cánh đồng mía của họ đang bị bệnh. Thậm chí, khi thấy ruộng
a) Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; b) Đốt thân ngắn; c) Vết đổi màu trong thân cây mía bệnh
mía có dấu hiệu chậm phát triển, người ta thường quy cho các nguyên nhân khác
như: điều kiện canh tác nghèo nàn, thiếu độ ẩm hoặc chất dinh dưỡng.
Vi khuẩn Lxx phát tán, lây lan trong đồng ruộng một cách nhanh chóng thông
qua các dụng cụ thu hoạch cơ giới hay thủ công, trong đó sự lây nhiễm do máy móc
khi thu hoạch cơ giới rất đáng kể. Các loài động vật ăn mía cũng có thể là tác nhân
truyền bệnh khi chúng gặm một thân mía bị bệnh sau đó lại tiếp tục gặm sang một
thân mía khỏe khác. Ngoài ra, có một vài báo cáo mới đây cho rằng vi khuẩn Lxx
vẫn tiếp tục sống sót trong đất sau khi thu hoạch và tái nhiễm vào rễ cây khỏe mạnh
thông qua vết thương; tuy nhiên, quy mô của sự lây nhiễm này vẫn chưa được biết
(Comstock và Lentini, 2005; Davis và Bailey, 2000).
Theo Bailey và Tough (1992); Damann (1992); Comstock và ctv. (1996), tùy
thuộc vào tính mẫn cảm của từng giống mía đối với bệnh mà mức độ lây nhiễm
cũng như mức thiệt hại khác nhau trong các cánh đồng. Thêm vào đó, các yếu tố bất
lợi về nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, ngập lụt hay khô hạn cũng góp phần làm gia tăng
tỉ lệ bệnh. Bệnh gây thiệt hại nặng nề hơn trong các vụ mía gốc, mía tái sinh từ gốc
sót lại cũng dễ dàng lây bệnh sang mía tơ (Westphal và Mirkov, 2003).

2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh
Bệnh cằn mía gốc được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến
sản lượng mía trên thế giới. Vi khuẩn Lxx chủ yếu làm cản trở sự vận chuyển nước
và chất dinh dưỡng của cây (Kao và Damann, 1978; 1980). Bởi vì cây mía có thể
phát triển thành 4 - 5 vụ mía gốc từ một vụ mía tơ nên phải thận trọng, tránh sự xâm
nhiễm của loại vi khuẩn này lên toàn bộ cánh đồng (Westphal và Mirkov, 2003).
Để tiêu diệt hay ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh nên ngâm mía trong
nước nóng (50 C) trong hai giờ trước khi đem trồng. Các dụng cụ thu hoạch phải
được rửa sạch và sát trùng bằng hóa chất trước khi thu hoạch sang ruộng khác. Các
chất diệt trùng hóa học có thể sử dụng đối với dụng cụ cắt mía bao gồm: lysol,
dettol, ethanol, mirrol and roccal. Nên cho hóa chất tiếp xúc với bề mặt cắt ít nhất 5
phút để đảm bảo chắc chắn vô trùng. Ngoài ra, sử dụng giống kháng cũng là một
biện pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh; mặc dù không có giống nào được tìm thấy là
miễn dịch hoàn toàn đối với sự xâm nhiễm của Lxx nhưng CP 78-1628 và CP 80-
1743 là 2 giống đã được chứng minh là có khả năng kháng đối với bệnh cằn mía
gốc (Comstock và Lentini, 2005).

2.4. Các phương pháp chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx
2.4.1. Phương pháp chẩn đoán truyền thống
Phương pháp chẩn đoán truyền thống dựa vào các triệu chứng biểu hiện bên
ngoài như sự cằn cỗi của cây, sự chuyển thành màu hồng tại mô mạch ở các mắt của
cây mía trưởng thành và màu hồng nhạt ở các lóng cây non (Hughes và Steindl,
1955). Tuy nhiên cường độ biểu hiện có sự khác nhau rất lớn giữa các giống cây
cũng như giữa các cây trong cùng một giống. Thêm vào đó, triệu chứng biểu hiện
của bệnh không khác gì mấy so với bệnh do các tác nhân thông thường gây ra trên
mía như côn trùng, các nhân tố môi trường và sự hủy hoại cơ học (Gillaspie và
Teakle, 1989) (Trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Do đó, bệnh cằn mía gốc
thường được xác định thông qua các kĩ thuật phòng thí nghiệm.

2.4.2. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi
Kiểm tra trực tiếp dịch chiết nước mía bằng kính hiển vi đối pha hoặc kính
hiển vi nền tối ở độ phóng đại X-1000 để phát hiện vi khuẩn nhưng phương pháp
này có độ nhạy thấp (khoảng 1 x 106
tế bào/ml) và chậm khi chọn lọc một số lượng
mẫu lớn (Taylor và ctv., 2003). Việc phát hiện vi khuẩn dưới kính hiển vi đặc biệt
khó khăn đối với cây bị nhiễm Lxx ở giai đoạn đầu, sau khi tưới hoặc trong mùa
mưa; bởi vào các thời điểm này, nồng độ vi khuẩn Lxx ở trong dịch chiết nước mía
rất thấp (Davis và Bailey, 2000). Do đó, hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc
rất nhiều vào kinh nghiệm của người quan sát.

2.4.3. Phương pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method )
Sự kí sinh của các tế bào vi khuẩn Lxx làm ngăn cản sự hấp thu nước và chất
dinh dưỡng của cây; sự tạo gel và chất gôm trong bó mạch mộc là dấu hiệu sinh lý
quan trọng liên quan đến sự giảm sản lượng ở cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Giglioti
và ctv., 1999). Dựa vào các đặc điểm trên, phương pháp nhuộm STM đã được phát
triển nhằm chẩn đoán, phát hiện cây mía bị bệnh.

2.4.4. Phương pháp huyết thanh học
Kĩ thuật huyết thanh bao gồm nhuộm kháng thể huỳnh quang (fluorescent-
antibody staining - FAT), kĩ thuật miễn dịch dot blot (dot blot immunoassay) và kĩ
thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay). Gần đây, người ta đã cải tiến
kĩ thuật miễn dịch dot blot thành kĩ thuật phân tích miễn dịch học enzyme liên kết
với mô mẫu (Tissue Blot Immunoassay - TBIA) để chẩn đoán bệnh và đánh giá
mức độ nghiêm trọng của bệnh. Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể phát hiện Lxx
trong một số lượng lớn mẫu mía một cách nhanh chóng; ngoài ra, kĩ thuật này còn
được sử dụng để chọn lọc dòng kháng bệnh và xác định mức độ tác động của bệnh
đối với cây giống (Comstock và Lentini, 2005).
Nhuộm kháng thể huỳnh quang: Harris và Gillaspie (1978) là những người
đầu tiên đưa ra phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (FAT) sử dụng kháng
huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Brlansky và ctv.
(1982) đã phát hiện Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc
hiệu để gắn kết Lxx với tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) (Trích dẫn
bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). Năm 1985, Davis phát triển kỹ thuật đếm trực tiếp
kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF) cho độ nhạy gấp 100 lần FAT.
Màng lọc được kiểm tra có vi khuẩn gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi
huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần (Trích dẫn bởi Westphal and Mirkov, 2003).
Kĩ thuật miễn dịch dot blot: dịch chiết nước mía (50 àl) được trộn với 10 mM
PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 (v:v). 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS được lọc qua
màng NCM 0,45 àm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở
80°C trong 60 phút trước khi đem nhuộm bằng phương pháp EIA/TBIA. Các phản
ứng dương tính được nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.
Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu: vi khuẩn được tách ra
khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm, được dính lên màng nitrocellulose (NCM) và được
nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dương
tính đối với vi khuẩn Lxx khi đem phân tích miễn dịch học.
Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay (EB – ELISA):
phương pháp EB - ELISA do Croft và ctv. đưa ra năm 1994 để chẩn đoán bệnh cằn
mía gốc. Dịch chiết nước mía được ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000
vòng trong 5 phút. Dịch nổi được loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550
àl dịch đệm. Mẫu phân tích được cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở
35°C.

2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc
2.5.1. Trên thế giới
Bệnh cằn mía gốc là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất tác động đến
năng suất và sản lượng mía trên thế giới. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế
giới đã đạt được một số thành công nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía
gốc. Năm 1945, Steind đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia
(trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Đến năm 1980, Davis và ctv. đã thành công khi
phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết nước mía trên môi trường nhân tạo. Năm 1998,
Pan và ctv. dùng kĩ thuật PCR để phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch khuẩn lạc nuôi
cấy và dịch chiết nước mía; cặp mồi Cxx được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA
dài 438 bp đặc hiệu cho tác nhân gây bệnh. Hoy và ctv. (1999) đã tiến hành so sánh
hiệu quả của các phương pháp khác nhau trong phát hiện dịch bệnh cằn mía gốc
trên cánh đồng. Năm 2002, Brumbley và ctv. đã chuyển gen và gây đột biến
Transposon thành công trên đối tượng vi khuẩn Lxx. Cặp mồi có độ nhạy và tính đặc
hiệu cao hơn cho phản ứng PCR phát hiện Lxx trong dịch chiết nước mía đã được phát triển bởi Taylor và ctv. (2003).
Năm 2004, Monteiro-Vitorello và ctv. đã thành công trong quá trình nghiên
cứu trình tự genome của vi khuẩn Gram dương Lxx. Cũng trong năm này, viện khoa
học nông nghiệp Tây Nam Trung Quốc đã phát hiện được vi khuẩn Lxx ở Quảng
Tây bằng kỹ thuật PCR. Đến năm 2006, Young và ctv. đã chứng minh sự ổn định
về mặt di truyền của 105 quần thể Lxx được phân lập từ các vùng trồng mía có sự
phân bố địa lý khác nhau trên thế giới (Indonesia, Nhật Bản, Hoa Kỳ, Brazil, Mali,
Zimbabwe, Nam Phi và Réunion).
Gần đây nhất, vào tháng 4 năm 2007, Grisham và ctv. đã tuyên bố thành công
trong việc chẩn đoán sớm dịch bệnh cằn mía gốc trên cánh đồng. Tác giả đã tiến
hành phản ứng Real – Time PCR để phát hiện vi khuẩn Lxx từ lá của cây mía còn
non. Đây là một nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong chiến lược đề phòng và
kiểm soát dịch bệnh từ giai đoạn sớm nhằm giảm thiệt hại do bệnh gây ra.
2.5.2. Trong nước
Bệnh cằn mía gốc đã được phát hiện ở nước ta từ rất lâu và gây thiệt hại
nghiêm trọng đối với nhiều vùng sản xuất (Hà Đình Tuấn, 2004). Tuy nhiên, loại
bệnh này vẫn chưa thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học. Các
nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trong nước chỉ tập trung vào khía cạnh điều tra,
khảo sát, đánh giá tỉ lệ bệnh cũng như tác hại của bệnh trên cánh đồng. Cho đến
nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về tác nhân gây bệnh cằn mía gốc.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo Tiếng Việt
1. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh lý thực vật đại cương. Phần I: Dinh dưỡng. Nhà
xuất bản đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Trang 34, 67 – 75.

2. Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996. Chương 8: Cây mía. Giáo trình cây công nghiệp
(Đoàn Thị Thanh Nhàn). Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. Trang 151 –
165.

3. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần bệnh hại mía trên một số giống mới
nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu
miền Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông Nghiệp, Đại học Nông
Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam.

4. Nguyễn Anh Khoa, 2006. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kĩ thuật ELISA và
bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kĩ thuật PCR. Khóa
luận tốt nghiệp Kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí
Minh, Việt Nam.

5. Nguyễn Huy Ước, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
Trang 78 – 79.

6. Nguyễn Huy Ước, 1999. Cây mía và kĩ thuật trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp
TP. Hồ Chí Minh. Trang 11 – 16.

7. Trần Linh Thước, 2003. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 74 – 77, 216.

8. Trần Thùy, 1996. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí
Minh. Trang 4 – 8.

9. Trần Văn Sỏi, 2001. Kỹ thuật trồng mía ở vùng đồi núi. Nhà xuất bản Nông
Nghiệp Hà Nội. Trang 3.

10. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. Trang 7.


Tài liệu tham khảo Tiếng Anh
11. Bailey R. A. and Bechet G. R., 1995. Further evidence of the effects ratoon
stunting disease on production under irrigated and rainfed conditions.
Proc. S. Afr. Sugar Technol. Assoc. 69: 74 – 78.

12. Bailey R. A., Tough S. A., 1992. Ratoon Stunting Disease: survival of
Clavibacter xyli subsp. xyli, in field soil and its spread to newly planted
sugarcane. Proceedings South African Sugar Techonogists Association
Annual Congress 66: 75 – 77.

13. Brumbley S. M., Petrasovits L. A., Hermann S. R., Young A. J. and Croft B.
J., 2006. Recent advances in the molecular biology of Leifsonia xyli
subsp. xyli, causal organism of ratoon stunting disease. Australian Plant
Pathology 35: 681 – 689.

14. Brumbley Stevens M., Petrasovits Lars A., Birch Robert G., and Taylor Paul
W. J., 2002. Transformation and transposon mutagenesis of Leifsonia
xyli subsp. xyli, causal organism of ratoon stunting disease of sugarcane.
Molecular Plant- Microbe Interactions 3: 262 – 268.

15. Comstock J. C. and Lentini R. S., 2005. Sugarcane Ratoon Disease. Florida
Sugarcane Handbook, an electronic publication of the Agronomy
Department.

16. Comstock J. C., Shine J. M., Davis M. J., and Dean J. L., 1996. Relationship
between resistance to Clavibacter xyli subsp. xyli colonization in
sugarcane and spread of ratoon stunting disease in the field. Plant
Disease 80: 704 – 708.

17. Damann K. E., 1992. Effect of sugarcane cultivar susceptibility on spread of
ratoon stunting disease by the menichal harvester. Plant Disease 76: 1148
– 1149.

18. Davis M. J. and Bailey R. A., 2000. Ratoon stunting. A Guide to Sugarcane
Diseases (Eds Rott P., Bailey R. A., Comstock J. C., Croft B. J. and
Saumtally A. S.). Montpellier, France. p 49 – 54.

19. Davis M. J., Dean J. L., 1984. Comparison of diagnostic techniques for
determining incidence of ratoon stunting disease of sugarcane in
Florida. Plant Disease 68: 896 – 899.


20. Davis M. J., Gilaspie A. G., Harris R. W., and Lowson R. H., 1980. Ratoon
Stunting Disease of sugarcane: Isolation of the causal bacterium. Science
210: 1365 – 1367.

21. Evtushenco Lyudmila I., Dorofeeva Lubov V., Subbotin Sergey A., Cole James
R. and Tiedje M., 2000. Leifsonia poae gen. nov., sp. nov., isolated from
nematode galls on Poa annua, and reclassification of “Corynebacterium
aquaticum” Leifson 1962 as Leifsonia aquatica (ex Leifson 1962) gen.
nov., nom. Rev., comb. Nov and Clavibacter xyli Davis et al, 1984 with
two subspecies as Leifsonia xyli (Davis et al, 1984) gen. nov., comb. nov.
International Journal of systematic and Evolutionary microbiology 50: 371 –
380.

22. Frison E. A. and Putter C. A. J., 2003. FAO/IBPGR Technical guidelines for
the safe movement of sugarcane germplasm. The International society of
sugar cane technologists, 15 – 41.

23. Grisham M. P., Pan Y. B., and Richard E. P., 2007. Early detection of
Leifsonia xyli subsp. xyli in sugarcane leaves by Real – Time Polymerase
Chain Reaction. Plant disease 91: 430 – 434.

24. Giglioti E. A., Comstock J. C., Davis M. J., Matsuoka S. and Tokeshi H., 1999.
Combining tissue blot enzyme immunoassay and staining by
transpiration methods to evaluate colonization of sugarcane stalks by
Clavibacter xyli subsp. xyli and its effects on the xylem functionality.
Summa Phytopathologica 25: 125 – 132.

25. Gillaspie A. G., Teakle D. S., 1989. Ratoon Stunting Disease. Diseases of
sugarcane: major diseases. (Eds Ricaud C., Egan B. T., Gillaspie A. G.,
Hughes C. G.). Elsevier Science Publishing, Inc., New York. p 59 – 80.

26. Harris R. W., Gillaspie A. G., 1978. Immunofluorescent diagnosis of ratoon
stunting disease. Plant Disease Report 62: 93 – 196.

27. Hoy J. W., Grisham M. P., Damann K. E., 1999. Spread and increase of
ratoon stunting disease of sugarcane and Comparision of disease
detection methods. Plant Disease 12: 1170 – 1175.

28. Kao J. and Damann K. E., 1978. Microcolonies of the bacterium associated
with ratoon stunting disease found in sugarcane xylem matrix.
Phytopathology 68: 545 – 551.


29. Kao J. and Damann K. E., 1980. In situ localization and morphology of the
bacterium associated with ratoon stunting disease of sugarcane. Can. J.
Bot. 58: 310 – 315.

30. Malcolm C. Shurtleff and Charles W. Averre III, 1997. The plant disease clinic
and field diagnosis of abiotic disease. APS PRESS, The American
Phytopathological Society. p 216.

31. Monteiro – Vitorello Claudia B., Camargo Luis E. A., Sluys Marie A. Van,
2004. The Genome sequence of the Gram – Positive Sugarcane Pathogen
Leifsonia xyli subsp. xyli. Molecular Plant – Microbes interaction 8: p 827 –
836.

32. Pan Y. B., Grisham M. P., and Burner D. M., 1998. A Polymerase Chain
Reaction Protocol for the Detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, the
causal bacterium of Sugarcane Ratoon Stunting Disease. Plant Disease
82: p 285 – 290.

33. Ricaud C., Egan B.T., Gillaspie A. G. and Hughes C.G., 1989. Disease of
sugarcane: Major diseases. International Society of Sugarcane Technologist.

34. Schaad N. W., 1994. Laboratory guide for identifycation of plant pathogenic
bacteria.2nd Edition. APS. PRESS, The American Phytopathological
Society.

35. Taylor P. W. J., Petrasovits L. A., Velde R. Vander, Birch R. G., Croft B. J.,
Fegan M., Smith G. R. and Brumbley S. M., 2003. Development of PCR-
based markers for detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in fibrovascular
fluid of infected sugarcane plants. Australasian Plant Pathology 32: 367 –
375.

36. Teakle D. S., Appleton J. M., Steindl D. R., 1978. An anatomical basis for
resistance of sugarcane to ratoon stunting disease. Physiol. Plant Pathol
12: 83 – 91.

37. Westphal Andreas and Mirkov T. Erik, 2003. Need for improved detection of
Ratoon Stunting Disease in sugarcane in South Texas. Subtropical Plant
Science 55: 68 – 71.

38. Young A. J., Brumbley S. M., 2004. Ratoon stungting disease: history,
management and current research. Sugarcane pathology. Vol III: Bacterial
and nematode diseases. (Eds Rao G. P., Saumtally A. S., Rott P.). Science
Publishers, Inc.: Enfield, NH. p 97 – 124.


39. Young A. J., Petrasovits L. A., Croft B. J., Gillings M. and Brumbley S. M.,
2006. Genetic uniformity of international isolates of Leifsonia xyli subsp.
xily, causal agent of ratoon stunting disease of sugarcane. Australasian
Plant Pathology 35: 503 – 511.

MỤC LỤC

Nội dung Trang
Lời cảm ơn . iii
Tóm tắt . iv
Summary vi
Mục lục vii
Danh sách các chữ viết tắt . x
Danh sách các bảng xi
Danh sách các hình . xii
1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu . 3
1.2.1. Mục đích . 3
1.2.2. Nội dung . 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía . 4
2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển . 4
2.1.2. Phân loại học 4
2.1.3. Phân bố . 5
2.1.4. Đặc điểm thực vật học 5
2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía . 5
2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển 6
2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía . 8
2.2. Các loại bệnh hại trên mía . 9
2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc . 12
2.3.1. Tác nhân gây bệnh 12
2.3.2. Triệu chứng . 13
2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh . 14 9
2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh . 15
2.4. Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Lxx 16
2.4.1. Phương pháp chẩn đoán truyền thống . 16
2.4.2. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi . 16
2.4.3. Phương pháp nhuộm STM 16
2.4.4. Phương pháp huyết thanh học . 17
2.4.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử . 18
2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc 19
2.5.1. Trên thế giới 19
2.5.2. Trong nước 20
3. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP . 21
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21
3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm . 21
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm 21
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 21
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ . 22
3.3. Phương pháp nghiên cứu 22
3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu 22
3.3.2. Phương pháp nhuộm STM 24
3.3.3. Phương pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của
cây mía bị bệnh 24
3.3.4. Phương pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng
định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được 24
3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn 24
3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate . 26
3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh
vật . 26
3.4. Bố trí thí nghiệm 27 10
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng
của cây mía bị bệnh . 29
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ
cây bị bệnh sau khi chủng 34
4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx . 38
4.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn
Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được . 41
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 45
5.1. Kết luận 45
5.2. Đề nghị . 45
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 47
Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 48
Tài liệu tham khảo Internet . 51