Tiến Sĩ Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm sen v

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT . iii
DANH MỤC CÁC BẢNG . v
DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ . viii
MỞ ĐẦU . 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. Thực vật học về Sen 4
1.2. Hóa học về Sen 7
1.3. Chiết xuất- phân lập các alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen . 12
1.4. Các phương pháp phân tích thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen . 16
1.5. Tác dụng sinh học của lá, tâm Sen . 19
1.6. Công dụng của Sen . 21
1.7. Chất đối chiếu . 22
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 25
2.1. Đối tượng nghiên cứu 25
2.2. Nguyên vật liệu – Dung môi, hóa chất, thuốc thử – Trang thiết bị . 25
2.3. Địa điểm nghiên cứu 28
2.4. Phương pháp nghiên cứu . 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47
3.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen 47
3.1.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá và tâm Sen 47
3.1.2. Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen 48
3.1.3. Phân lập alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen . 48
3.1.4. Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen 60
3.1.5. Xác định cấu trúc các chất phân lập được . 61
3.2. Thiết lập một số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen . 80 ii
3.3. Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid
có trong lá và tâm Sen . 85
3.4. Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid,
flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen . 104
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 108
4.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc cấu trúc các alkaloid, flavonoid phân lập
từ lá và tâm Sen . 108
4.2. Qui trình định tính, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong
lá và tâm Sen . 117
4.3. Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid
có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm từ lá, tâm Sen . 124
4.4. Đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen 127
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC














iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile
ASEAN Association of Southeast Asian Nations
(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)
CĐC Chất đối chiếu
CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản)
Corr Area Corrected Area (Diện tích pic được chuẩn hóa)
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
CZE Capillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng)
d doublet (đỉnh đôi)
DVT Dấu vân tay
DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DSC Differential Scanning Calorimetry (Quét nhiệt vi sai)
DMSO Dimethylsulfoxide
ĐDĐ Điện di đồ
DTAB Dodecyltrimethylammonium bromide
ESI Electrospray Ionization (Ion hóa phun mù electron)
EOF Electro-osmotic flow (Dòng điện thẩm)
FCPC Fast centrifugal partition chromatography (Sắc ký phân bố
ly tâm nhanh)
GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc)
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao)
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation
ICH International Conference on Harmonization
IR Infrared (Hồ ng ngoại)
i-ProOH Isopropanol iv
J Coupling constant (Hằ ng số ghép )
LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)
LDL Low density lipoprotein
LOD Limit of detection
LOQ Limit of quantitation
MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động)
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 (Tế bào ung thư vú dòng MCF-7)
MS Mass Spectrometry (Khối phổ)
NACE Non aqueous capillary electrophoresis
NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưở ng từ hạ t nhân )
PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang)
PE Petroleum ether (ether dầu hỏa)
PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp)
PTN Phòng thí nghiệm
RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)
s singlet (Đỉnh đơn)
SKĐ Sắc ký đồ
SCRS Secondary Chemical Reference Standard
(Chất đối chiếu hóa học thứ cấp)
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn)
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TEA Triethylamin
TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng)
THF Tetrahydrofuran
TLTK Tài liệu tham khảo
TT Thuốc thử
UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)
VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không) v
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Nelumbo 4
Bảng 1.2. Các alkaloid khung aporphin có trong lá Sen 8
Bảng 1.3. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong lá Sen 8
Bảng 1.4. Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong tâm Sen . 10
Bảng 1.5. Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có trong tâm Sen 11
Bảng 1.6. Tóm tắt các nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen . 12
Bảng 1.7. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng alkaloid, flavonoid lá và tâm Sen 16
Bảng 2.1. Nơi thu hái nguyên liệu lá và tâm Sen loài Nelumbo nucifera G. . 26
Bảng 2.2. Nơi thu hái nguyên liệu lá Sen loài N. Lutea Willd và Victoria regia. 26
Bảng 2.3. Các chế phẩm có chứa lá và tâm Sen. 26
Bảng 2.4. Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen. . 30
Bảng 2.5. Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 và tủa F từ lá Sen. 33
Bảng 2.6. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cao A3, cao N lá Sen. . 34
Bảng 2.7. Điều kiện tiến hành sắc ký cột phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen . 34
Bảng 2.8. Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 phân đoạn F1, F6, F8 . 35
Bảng 2.9. Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho
FCPC phân đoạn P-2 . 36
Bảng 3.1. Kết quả chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen 47
Bảng 3.2. Kết quả chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen . 47
Bảng 3.3. Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen 48
Bảng 3.4. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A2, lá Sen. 50
Bảng 3.5. Kết quả thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1 . 50
Bảng 3.6. Kết quả thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2 . 50
Bảng 3.7. Kết quả thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 51
Bảng 3.8. Kết quả thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 . 51
Bảng 3.9. Kết quả thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6 51
Bảng 3.10. Kết quả thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 và A2-12 . 52
Bảng 3.11. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A3 lá Sen 52 vi
Bảng 3.12. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao N lá Sen 52
Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột silica gel trên tủa F, lá Sen . 53
Bảng 3.14. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F1 53
Bảng 3.15. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3 54
Bảng 3.16. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7 . 54
Bảng 3.17. Kết quả thu hứng LF-2 và LF-4 từ F7-3 54
Bảng 3.18. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F8 54
Bảng 3.19. Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen 55
Bảng 3.20. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP5, tâm Sen . 57
Bảng 3.21. Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP8, tâm Sen . 57
Bảng 3.22. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn P . 58
Bảng 3.23. Kết quả FCPC phân đoạn P-2 58
Bảng 3.24. Kết quả Sephadex LH-20 của phân đoạn n-Bu . 58
Bảng 3.25. Kết quả các phân đoạn sau SPE từ n-Bu II 59
Bảng 3.26. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EF, tâm Sen 59
Bảng 3.27. Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn EF-8, tâm Sen . 59
Bảng 3.28. Độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen . 60
Bảng 3.29. Dữ liệu phổ UV, MS của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 61
Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 13 C- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 . 61
Bảng 3.31. Dữ liệu phổ 1 H- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 62
Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 13 C và 1 H-NMR của LN-5 63
Bảng 3.33. Dữ liệu phổ UV, MS của LN-8, LN-9 . 64
Bảng 3.34. Dữ liệu phổ 13 C và 1 H- NMR của LN-8, LN-9. . 64
Bảng 3.35. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-1, EN-2, EN-3 . 65
Bảng 3.36. Dữ liệu phổ 13 C và 1 H- NMR của EN-1, EN-2, EN-3. . 66
Bảng 3.37. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của các alkaloid EN-4, EN-5 . 67
Bảng 3.38. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-4 67
Bảng 3.39. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-5 . 69
Bảng 3.40. Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 74
Bảng 3.41. Dữ liệu phổ 13 C-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75 vii
Bảng 3.42. Dữ liệu phổ 1 H-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 . 75
Bảng 3.43. Dữ liệu phổ UV, MS của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 . 76
Bảng 3.44. Dữ liệu phổ 13 C-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 76
Bảng 3.45. Dữ liệu phổ 1 H-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 77
Bảng 3.46. Dữ liệu phổ UV, MS của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 78
Bảng 3.47. Dữ liệu phổ 13 C-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 78
Bảng 3.48. Dữ liệu phổ 1 H-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 . 79
Bảng 3.49. Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và nhiệt độ
nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3) 81
Bảng 3.50. Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết
HPLC-PDA của 06 CĐC 82
Bảng 3.51. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC
của 06 CĐC . 82
Bảng 3.52. Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của qui trình
phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC . 82
Bảng 3.53. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu thiết lập CĐC . 83
Bảng 3.54. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử của các CĐC . 84
Bảng 3.55. Kết quả đánh giá đồng nhất lô của quá trình đóng lọ các CĐC . 84
Bảng 3.56. Kết quả đánh giá liên PTN của các nguyên liệu thiết lập CĐC . 85
Bảng 3.57. Kết quả xác định giá trị ấn định của các CĐC sau khi đóng gói . 85
Bảng 3.58 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian,
độ đúng qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong mẫu nguyên liệu lá sen
(NN-1 a ) bằng phương pháp CE-PDA/MS . 90
Bảng 3.58. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong
lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM 100
Bảng 3.59. Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong
lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM 101
Bảng 3.60. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần
alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA . 102
viii
Bảng 3.61. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần
flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC/PDA . 102
Bảng 3.62. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần
alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA 103
Bảng 3.63. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần
flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA 103
Bảng 3.64. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần
flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE/PDA 104
Bảng 3.65. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần
flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA . 104
Bảng 3.66. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần
alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS 104
Bảng 3.67. Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần
alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS 105
Bảng 3.68. Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100 mg) có trong mẫu
nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng
phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA 106
Bảng 3.69. Kết quả xác định hàm lượng của các alkaloid (mg/100 mg) có trong
07 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N. nucifera bằng phương pháp CE-PDA/MS và
HPLC-PDA . 106
Bảng 3.70. Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100mg) có trong mẫu
nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng
phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA . 107
Bảng 3.71. Kết quả xác định hàm lượng của các flavonoid (mg/100 mg) có trong
06 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N. nucifera bằng phương pháp CE-PDA và
HPLC-PDA . 107
Bảng 4.1. Độ dịch chuyển trên phổ 13 C và 1 H để phân biệt 05 alkaloid
LN-1, LN-2, LN-3, LN-4, LN-5 114
Bảng 4.2. Độ dịch chuyển trên phổ 13 C và 1 H để phân biệt 05 alkaloid
EN-1, EN-2, EN-3, EN-4, EN-5 115 ix
Bảng 4.3. Độ dịch chuyển trên phổ 13 C và 1 H để phân biệt 04 alkaloid
EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 . 116
Bảng 4.4. Độ dịch chuyển trên phổ 13 C và 1 H để phân biệt 02 alkaloid
LN-9, LN-10 . 117
Bảng 4.5. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong
lá Sen (N. nucifera) Việt Nam . 127
Bảng 4.6. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong
tâm Sen (N. nucifera) Việt Nam . 127
Bảng 4.7. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất
có trong lá Sen (N. nucifera) Việt Nam 127
Bảng 4.8. Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có
trong tâm Sen (N. nucifera) Việt Nam 127