Luận Văn Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) kháng sâu xanh (

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
NĂM - 2012

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Ký hiệu và chữ viết tắt trong luận án
Danh mục bảng trong luận án
Danh mục hình trong luận án


MỞ ĐẦU .
1. Tính cấp thiết của đề tài
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3. Mục đích và yêu cầu của đề tài .
3.1. Mục đích của đề tài .
3.2. Yêu cầu của đề tài .
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài .
4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài
5. Đóng góp mới của luận án




Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam
1.1.1. Sơ lược về cây bông
1.1.2. Tình hình sản xuất bông trên thế giới .
1.1.3. Tình hình chọn tạo và sản xuất bông ở Việt Nam .
1.2. Sâu hại bông và tổn thất gây ra
1.2.1. Sâu hại bông
1.2.2. Tổn thất do sâu hại bông và chi phí phòng trừ
1.3. Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu
1.4. Ý nghĩa của trồng bông Bt kháng sâu
1.4.1. Tăng năng suất .
1.4.2. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu .
1.5. Sơ lược lịch sử khám phá gen Bt .
1.6. Tái sinh cây bông .
1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma
1.6.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi .
1.7. Chuyển gen cây bông .
1.7.1. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens
1.7.2. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn
1.7.2.1. Cơ chế của chuyển gen PTP
1.7.2.2. Tiến bộ của chuyển gen PTP ở cây bông
1.7.2.3. Thuận lợi và khó khăn của chuyển gen PTP .
1.7.2.4. Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen PTP .
1.7.2.5. Nguyên tắc cơ bản trong thao tác vi tiêm
1.8. Sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen
1.8.1. Sàng lọc tế bào, mô hoặc cây chuyển gen nhờ gen chỉ thị chọn lọc .
1.8.1.1. Gen chỉ thị chọn lọc .
1.8.1.2. Gen chỉ thị chọn lọc thông dụng
1.8.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chuyển gen .
1.8.2.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào bằng PCR
1.8.2.2. Xác định sự gắn kết và số bản sao gen chuyển bằng Southern blot
1.8.3. Đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen .
1.8.3.1. Đánh giá hoạt động phiên mã của gen chuyển bằng Northern blot
1.8.3.2. Đánh giá hoạt động dịch mã của gen chuyển bằng Western blot .
1.8.4. Đánh giá tính kháng sâu của cây bông chuyển gen Bt

Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống bông
2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn .
2.1.3. Cặp mồi đặc hiệu .
2.1.4. Hoá chất .
2.1.5. Máy móc, thiết bị .
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .
2.2.1. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens
49
2.2.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma
2.2.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi .
2.2.1.3. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens
2.2.2. Chuyển gen vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn .
2.2.2.1. Xác định thông số vi tiêm
2.2.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T0
2.2.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen .
2.2.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh .
2.2.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR
2.2.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây chuyển gen .




Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .
60
3.1. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens
3.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma
3.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi .
3.1.3. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens
3.1.3.1. Xác định thông số chuyển gen .
3.1.3.2. Thực hiện chuyển gen .
3.2. Chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn
3.2.1. Xác định thông số vi tiêm
3.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T0 .
3.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen .
3.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh .
3.3.1.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin .
3.3.1.2. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin .
3.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR
3.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây bông chuyển gen
3.3.3.1. Đánh giá tính kháng sâu xanh của 7 dòng chuyển gen thế hệ T2 giống Coker312 và SSR60F .
3.3.3.2. Đánh giá tính kháng sâu xanh của 80 dòng chuyển gen thế hệ T2 giống LRA5166, MCU9 và TM1
3.3.3.3. Đặc tính kháng sâu xanh của các dòng chuyển gen thế hệ T2
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .
1. Kết luận .
2. Đề nghị
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI .
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .
PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trên thế giới, bông (Gossypium sp.) là cây trồng kinh tế lấy sợi tự nhiên quan trọng nhất. Hiện nay, cây bông được trồng ở gần 100 quốc gia, với diện tích niên vụ 2010/2011 khoảng 33,3 triệu ha, sản lượng đạt 25,1 triệu tấn bông xơ, giá trị trên 50 tỷ USD (ICAC, 2012 [67]). Tuy nhiên, cây bông bị nhiều loài sâu gây hại. Trước khi có bông Bt, hàng năm, mức tổn thất do sâu hại gây ra chiếm 24,5% tổng sản lượng bông và tiêu tốn lượng thuốc trừ sâu chiếm 25% tổng lượng thuốc sử dụng trong nông nghiệp, trong khi, diện tích trồng bông chỉ chiếm 2,4% tổng diện tích đất trồng trọt toàn cầu (Krattiger, 1997) [79]. Để khắc phục tổn thất do sâu hại gây ra, tăng hiệu quả kinh tế cây bông và bảo vệ môi trường sinh thái, các nước trồng bông lớn đã sử dụng phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu.
Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống, được trồng nhiều ở vùng Tây Bắc, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam bộ. Tuy nhiên, diện tích và sản lượng rất thấp, chỉ đáp ứng 5% nhu cầu ngành dệt may [15]. Có nhiều nguyên nhân hạn chế mở rộng diện tích và tăng sản lượng bông nước ta, nhưng quan trọng nhất từ trước tới nay vẫn là sâu hại. Trong điều kiện nhiệt đới ẩm như ở nước ta, sâu hại thường phát sinh và gây hại quanh năm trên cây bông. Các loài sâu hại phổ biến là sâu xanh, sâu keo, sâu khoang và sâu hồng. Trong số đó, sâu xanh là loài nguy hiểm nhất, có mặt và gây hại nặng ở hầu hết các vùng trồng bông từ Bắc tới Nam và là đối tượng cần phòng trừ (Ngô Trung Sơn, 1999 [11]; Nguyễn Hữu Bình, 1990 [1]; Nguyễn Thị Hai, 1996 [5]). Trong đó, biện pháp phòng trừ bằng giống kháng đã được đặt ra. Tuy nhiên, đến nay, chúng ta vẫn chưa tạo được giống bông kháng sâu tốt vì không tìm thấy nguồn gen kháng sâu xanh hiệu quả trên cây bông.


Theo Chương trình phát triển cây bông đến 2015 và định hướng đến 2020 [13], Việt Nam cần phát triển theo hướng tăng cường đầu tư thâm canh nâng cao năng suất, chất lượng, đảm bảo hiệu quả kinh tế, nâng cao sức cạnh tranh của cây bông và bảo vệ môi trường sinh thái; với chỉ tiêu đến năm 2015, đạt 20 nghìn tấn bông xơ và đến 2020 là 60 nghìn tấn. Để thực hiện được điều này, bên cạnh áp dụng các giải pháp quy hoạch, đầu tư, tài chính , thì giải pháp khoa học công nghệ mà trong đó ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết.
Để tạo cây bông Bt, chủ yếu sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens, vì có ưu điểm đơn giản, chi phí thấp, không cần thiết bị đặc biệt, số bản sao gen chuyển thấp và di truyền ổn định. Tuy nhiên, phương pháp này phụ thuộc hệ thống tái sinh mất nhiều thời gian, tỷ lệ tái sinh thấp và bị giới hạn bởi kiểu giống. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn là phương pháp mới, có ưu điểm thao tác đơn giản, tỷ lệ chuyển gen khá cao, khắc phục được những hạn chế của tái sinh và có thể chuyển gen vào bất kỳ giống bông nào. Mặc dù, cũng có nhược điểm như quy mô chuyển gen lớn, tốn nhiều công lao động, phụ thuộc vào ngoại cảnh, nhưng phương pháp chuyển gen này đang ngày càng được quan tâm sử dụng.
Xuất phát từ những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) kháng sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner)” được tiến hành.


2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học và phương pháp cơ bản về tái sinh và chuyển gen cây bông; sàng lọc, đánh giá và chọn lọc cây bông chuyển gen kháng sâu xanh; và góp phần phát triển lĩnh vực khoa học chọn tạo giống cây trồng kháng sâu.
- Đưa kỹ thuật chuyển gen cây bông trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống bông truyền thống và làm cơ sở áp dụng để chọn tạo các loại giống cây trồng kháng sâu khác.


2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo ra dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh để làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu, nhằm cung cấp cho sản xuất bông hàng hóa trong nước.
- Nhờ có giống bông chuyển gen kháng sâu xanh sử dụng trong sản xuất, góp phần giảm thiểu rủi ro cho nông dân, giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành sản phẩm, tăng thu nhập cho người trồng bông, bảo vệ môi trường sống và tính bền vững của hệ thống sản xuất nông nghiệp.
- Nhờ có giống bông chuyển gen kháng sâu xanh sử dụng trong sản xuất, tạo bước tăng trưởng đột phá về diện tích và sản lượng, từng bước đáp ứng nhu cầu bông xơ ngày càng tăng của ngành dệt may Việt Nam.
3. Mục đích và yêu cầu của đề tài
3.1. Mục đích của đề tài
- Ứng dụng được phương pháp chuyển gen để chuyển thành công gen CryIAc vào một số giống bông, đặc biệt là giống bông Việt Nam.
- Tạo ra một số dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh cao (tỷ lệ giết sâu ≥ 80%) làm vật liệu quý cho chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước.
3.2. Yêu cầu của đề tài
- Chuyển được gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn.
- Sàng lọc, đánh giá và chọn lọc được một số dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh cao.