Thạc Sĩ Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex ligation - dependent probe amplification để phát hiện lệch bộ

MỞ ĐẦU

Theo các nghiên cứu được thực hiện trong thời gian qua, mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 1,5% đến 3% trẻ sinh ra có dị tật bẩm sinh. Khoảng 60% trường hợp dị tật bẩm sinh chưa xác định được nguyên nhân và khoảng từ 20% đến 40% là do di truyền. Nhằm giảm tỷ lệ dân số bị thiểu năng về thể lực và trí tuệ, các chương trình sàng lọc trước sinh cùng với phương pháp chẩn đoán chuyên sâu nhằm phát hiện và can thiệp sớm các rối loạn di truyền ngay trong giai đoạn bào thai đã được áp dụng ở các bệnh viện lớn như Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Từ Dũ TP. Hồ Chí Minh.
Trong lĩnh vực chẩn đoán trước sinh, kỹ thuật nuôi cấy tế bào và phân tích karyotype, gọi tắt là karyotyping, được xem là một chuẩn mực vàng. Kỹ thuật này cho phép phát hiện cùng lúc nhiều trường hợp bất thường về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể với độ chính xác rất cao. Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế như thao tác phức tạp, giá thành cao, thời gian thực hiện dài. Bên cạnh karyotyping, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescent In Situ Hybridization – FISH) cũng được xem là một lựa chọn trong chẩn đoán trước sinh. Trong kỹ thuật này, các mẫu dò phân tử có đánh dấu chất phát huỳnh quang bắt cặp chuyên biệt tại một vùng nhiễm sắc thể nhất định được sử dụng để xác định số lượng của các nhiễm sắc thể. Mặc dù vượt trội karyotyping về mặt thời gian thực hiện, nhưng do chi phí hóa chất cao, yêu cầu thiết bị đắt tiền nên kỹ thuật FISH khó có thể được ứng dụng rộng rãi ở một nước đang phát triển như Việt Nam.
Năm 2002, kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời, đem đến một sự lựa chọn mới trong việc chẩn đoán các hội chứng di truyền do bất thường nhiễm sắc thể như trisomy 21, 13, 18 và nhiễm sắc thể giới tính. So với karyotyping và FISH, kỹ thuật MLPA có các ưu điểm nổi bật như thời gian thực hiện ngắn, thao tác đơn giản, yêu cầu thiết bị đơn giản và cho phép phân tích cùng lúc nhiều mẫu. Điểm hạn chế duy nhất khi sử dụng MLPA hiện nay là phải phụ thuộc hoàn toàn vào hóa chất ngoại nhập từ hãng sản xuất và phân phối độc quyền MRC-Holland (Hà Lan), trong đó quan trọng nhất là các mẫu dò có chiều dài lớn từ 200 đến 400 nucleotide. Cho đến nay chưa có công trình nào ở Việt Nam nghiên cứu xây dựng quy trình sử dụng kỹ thuật MLPA như một công cụ chẩn đoán các rối loạn di truyền trước sinh.
Mục tiêu của đề tài là xây dựng quy trình MLPA sử dụng mẫu dò ngắn và dài để phát hiện các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18 và 21.
Nội dung của đề tài bao gồm:
1) Thiết kế, thử nghiệm và khảo sát các điều kiện sử dụng mẫu dò ngắn
2) Tạo mẫu dò dài bằng phản ứng PCR và kiểm tra hoạt động của mẫu dò dài trong hỗn hợp mẫu dò
3) Đánh giá độ ổn định và khả năng phát hiện trisomy của quy trình Sự thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc ứng dụng kỹ thuật MLPA ở Việt Nam trong lĩnh vực chẩn đoán tiền sinh như một công cụ bổ trợ cho những phương pháp đã có. Ngoài ra, nhờ khả năng phân tích cùng lúc nhiều vùng khác nhau trong bộ gene, kỹ thuật MLPA còn có thể được ứng dụng trong chẩn đoán để phục vụ điều trị ung thư, xác định kiểu gene liên quan đến mức độ đáp ứng điều trị ở một số bệnh v.v

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 1
DANH MỤC BẢNG .4
DANH MỤC HÌNH 5
MỞ ĐẦU 8
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu các rối loạn di truyền ở người 11
1.2. Giới thiệu sơ nét hội chứng Down, hội chứng Edwards và hội chứng Patau .12
1.2.1. Hội chứng Down .12
1.2.2. Hội chứng Edwards .16
1.2.3. Hội chứng Patau 18
1.3. Giới thiệu phương pháp sàng lọc và chẩn đoán các hội chứng rối loạn di truyền 18
1.3.1. Phương pháp sàng lọc triple test 19
1.3.2. Phương pháp chẩn đoán 23
1.3.2.1. Kỹ thuật thu mẫu tế bào thai nhi .23
1.3.2.2. Kỹ thuật phân tích kiểu nhân (karyotype) 25
1.3.2.3. Kỹ thuật FISH .29
1.3.2.4. Kỹ thuật QF-PCR (Quantitative Fluorescence PCR) .30
1.4. Tình hình ứng dụng các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán ở Việt Nam 32
1.5. Giới thiệu kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)33
1.5.1. Nguyên lý kỹ thuật MLPA 34
1.5.2. Quy trình thiết kế mẫu dò MLPA bằng phương pháp sử dụng phage M13 35
1.5.3. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật MLPA .37
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu .40
2.1.1. Mẫu nghiên cứu 40
2.1.2. Hóa chất 40
2.1.2.1. Hóa chất cơ bản 40
2.1.2.2. Hóa chất tách chiết DNA bằng phương pháp cột silica-membrane .41
2.1.2.3. Hóa chất trong quy trình MLPA 41
2.1.2.4. Hóa chất điện di trên gel agarose .42
2.1.2.5. Hóa chất điện di trên hệ thống Experion .42
2.1.2.6. Hóa chất PCR Pfu .43
2.1.2.7. Hóa chất tinh sạch DNA .43
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị, phần mềm .43
2.2. Phương pháp nghiên cứu 43
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA thai nhi từ nước ối 43
2.2.2. Phương pháp thiết kế mẫu dò ngắn 45
2.2.3. Phương pháp tạo mẫu dò dài bằng phản ứng PCR sử dụng Pfu .49
2.2.4. Phương pháp tinh sạch mẫu dò dài từ hỗn hợp phản ứng PCR 51
2.2.5. Quy trình MLPA .52
2.2.6. Phương pháp điện di trên gel agarose 53
2.2.7. Phương pháp phân tách sản phẩm PCR bằng hệ thống điện di tự động
Experion .54
2.2.8. Phương pháp chuẩn hóa kết quả điện di trên hệ thống Experion 55
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1. Nhóm thí nghiệm trên mẫu dò nhân tạo ngắn .58
3.1.1. Thiết kế 15 cặp mẫu dò ngắn .58
3.1.2. Kiểm tra khả năng hoạt động của các mẫu dò ngắn .59
3.1.3. Khảo sát các đặc điểm quan trọng của mẫu dò MLPA .60
3.1.3.1. Chiều dài mẫu dò 60
3.1.3.2. Nucleotide đầu tiên sau vùng bắt cặp của mồi trên LPO .62
3.1.3.3. Nồng độ mẫu dò 64
3.2. Nhóm thí nghiệm trên mẫu dò dài 65
3.2.1. Kiểm tra hiệu quả của phản ứng tạo mẫu dò dài bằng Pfu .66
3.2.2. Kiểm tra hoạt động của mẫu dò dài .68
3.2.3. Kiểm tra hoạt động của mẫu dò dài trong hỗn hợp mẫu dò 69
3.2.4. Xác định nồng độ hoạt động của mẫu dò dài trong hỗn hợp mẫu dò 71
3.3. Kiểm tra khả năng phát hiện trisomy của hai hỗn hợp mẫu dò 72
3.4. Đánh giá độ ổn định của quy trình 74
3.5. Kiểm tra 25 mẫu nước ối bằng quy trình MLPA .78
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận .83
4.2. Đề nghị 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO .85
PHỤ LỤC 94