Luận Văn Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Enzyme đế sản xuất hợp chất thơm dẫn xuất carotenoids

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Enzyme đế sản xuất hợp chất thơm dẫn xuất carotenoids


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . i
MỤC LỤC . ii
DANH MỤC CÁC HÌNH .v
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN . 3
1.1. Tổng quan về carotenoid . 3
1.1.1.về carotenoid 3
1.1.2. Phân loại carotenoid 4
1.1.2.1. Nhóm carotene 4
1.1.2.2 Nhóm xanthophylls 5
1.1.3 Tính chất vật lý, tính chất quang phổ .6
1.1.4. Hoạt tính sinh học và vai trò của carotenoid .8
1.1.5. Một s ố carotenoids điển hình 8
1.1.5.1. β-carotene 8
1.1.5.2. Lycopene 14
1.1.6. Các nguồn carotenoids trong tự nhiên 16
1.1.6.1. Nguồn carotenoids từ Gấc . 18
1.1.6.2. Nguồn carotenoids từ nấm sợi Blakeslea trispora 21
1.2. Sự oxy hóa phân tử carotenoids –Hợp chất
apocarotenoids .23
1.2.1. Sự oxy hóa phân tử carotenoids 22
iii
1.2.1.1. Một số enzyme sử dụng để chuyển hóa carotenoids thành chất thơm . 27
1.2.2. Các hợp chất apocarotenoids 29
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32
2.1. Mục tiêu nghiên cứu . 32
2.2. Vật liệu, Hóa chất và dụng cụ . 32
2.2.1. Vật liệu 32
2.2.2. Các hóa chất . 32
2.2.3. Các chất chuẩn . 36
2.2.4. Dụng cụ . 36
2.3. Phương pháp nghiên cứu . 36
2.3.1.Tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau . 36
2.3.1.1. Tách chiết carotenoids từ cà rốt và gấc 36
2.3.2. Chuyển hóa carotenoids thành chất thơm . 40
2.3.2.1 Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình tự oxy hóa của carotenoids 40
2.3.2.2. Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình bổ sung Enzyme để oxy hóa
carotenoids 41
2.4. Phương pháp phân tí ch . 42
2.4.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS 42
2.4.2. Phương pháp sắc kí bản mỏng TLC . 44
2.4.3. Phân tích các thành phần chất thơm bằng sắc kí khí (GC) . 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47
3.1. Kết quả tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau. 47
3.2. Kết quả sắc kí bản mỏng TLC 49
3.3. Sự phân rã của carotenoids/β-carotene trong quá trình tự oxy hóa. . 52
iv
3.3.1.Khảo sát sự phân rã β-carotene từ các carotenoids có nguồn gốc khác nhau.
52
3.3.2. Nghiên cứu khảo sát sự tạo thành các chất thơm trong phản ứng tự oxy hóa
carotenoids từ dầu gấc . 54
3.4. Nghiên cứu khảo sát sự tạo thành các chất thơm từ carotenoids dầu gấc trong
phản ứng đồngoxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxydase 55
3.5. Khảo sát sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.trispora và tạo
thành chất thơm trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase. . 57
3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất đến sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B. trispora và hình thành chất thơm trong quá
trình đồng oxy hóa . 58
CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 64
4.1. Kết luận 64
4.2. Kiến nghị 64
4.2.1. Nghiên cứu quá trình chuyển hóa sinh học β-carotene thành chất thơm 65
4.2.2. Nghiên cứu tách chiết, thu hồi sản phẩm 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 66
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của β-caroten 5
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Lycopene 5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của lutein và zeaxanthin 5
Hình 1.4. Phổ hấp thụ của một số carotenoids 7
Hình 1.7: Trái gấc 20
Hình 1.8: Các thành phần hợp chất bay hơi chính khi phân cắt β-carotene . 23
Hình 1.10. Các bước trong quá trình chuyển hóa carotenoids thành chất thơm . 25
Hình 1.11. Các bước cơ bản chuyển hóa carotenoids thành chất thơm: trường hợp của
beta-ionone và beta-damascenone từ beta-carotene và neoxanthin . 26
Hình1.1. Cấu trúc tinh thể enzyme Xanthine oxidase tách chiết từ bò . 28
Hình 1.14. Một số apocarotenoid tạo thành khi phân cắt beta-caroten 30
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ cà rốt và Gấc. . 39
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ nấm sợi . 39
Hình 2.3. Phổ hấp thụ của Lycopene trong mẫu chuẩn và mẫu dầu Gấc . 43
Hình 2.4. Phổ hấp thụ của beta-carotene trong mẫu chuẩn và mẫu dầu Gấc . 43
Hình 3.2. Kết quả phân tí ch TLC carotenoids/β-carotene từ dầu Gấc và từ Beta-carotene tinh khiết . 50
Hình 3.3.Phổ hấp thụ thu được từ bản sắc kí, giống với phổ của 51
beta-carotene . 51
Hình 3.4. Phổ hấp thụ thu được từ bản sắc kí, giống với phổ của Lycopene 51
Hình 3.5: Sự thay đổi hàm lượng β-carotene từ các nguồn khác nhau theo thời gian . 53
Hình 3.6. Sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.trispora trong quá
trình đồng oxy hóa sử dụng enzyme XO ở các nồng độ khác nhau . 60
Hình 3.7. Biểu đồ hiệu suất chuyểnhoá β-cyclocitral với các nồng độ enzyme và cơ
chất khác nhau . 61
Hình 3.8. Biểu đồ hiệu suất chuyển hoá β-ionone với các nồng độ enzyme và cơ chất
khác nhau 62
Hình 3.9. Biểu đồ hiệu suất chuyển hoá DHA với các nồng độ enzyme . 62
và cơ chất khác nhau . 63
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1.1. Quang phổ hấp thụ của một s ố carotenoids điển hình . 6
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của phương thức chế biến đến hàm lượng beta-carotene . 9
Bảng 1.3: Bảng thành phần của beta-carotene trong 1 số loài thực vật phổ biến tại Việt
Nam 17
Bảng 1.4. Hàm lượng một số carotenoids trong các mẫu thực vật .18
Bảng 1.5. Lượng beta-carotene có trong 100g thực phẩm Error! Bookmark not
defined.
Bảng 1.6. Sản phẩm phân rã chung của carotenoid tìm thấy trong thực vật . 30
Bảng 3.1. Kết quả tách chiết carotenoid tổng số (µg/g) khối lượng tươi từ ba nguồn cà
rốt, Gấc và nấm sợi B.trispora . 47
Bảng 3.2. Sựphân rã của beta-carotene từ các nguồn khác nhau trong quá trình tự oxy
hóa. . 52
Bảng 3.3. Sự phân rã β-carotene dầu màng gấc và tạo thành chất thơm trong phản ứng
tự oxy hóa . 54
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dầu màng gấc đến sự phân rã β-carotene và tạo thành
chất thơm trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng xanthine oxidase 55
Bảng 3.5. Sự phân rã β-carotene sinh khối nấm sợi B. trispora và tạo thành chất thơm
trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase . 57
Bảng 3.6. Sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B. trispora trong quá
trình đồng oxy hóa sử dụng enzyme XO ở các nồng độ khác nhau . 58
Bảng 3.7. Hiệu suất chuyển hóa β-carotene thành chất thơm trong quá trình đồng oxy
hóa β-carotene từ sinh khối nấm sợi B. trispora với các nồng độ XO và cơ chất
acetaldehyde khác nhau . 60
vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BHT Butylated hydroxytoluene
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
GC Gas chromatography
HPLC High-performmance liquid chromatography
LOX Lipoxygenases
OD Optical Density
TLC Thin layer chromatography
UV/VIS Ultraviolet-visible spectrophotometry
XO Xanthine oxidase
HSCH Hiệu suất chuyển hóa
1
MỞ ĐẦU
Từ thời xa xưa, khi mà công nghệ sản xuất chất thơm chưa được biết đến
con người đã biết dùng hoa, lá của các loại thực vật (như hoa hồng) để nấu nước
tắm, gội đầu cho thơm. Ngày nay, khi đời sống ngày càng phát triển, xã hội càng
văn minh thì các chấtthơm được sản xuất và sử dụng ngày càng đa dạng và
phong phú cả về số lượng lẫn chất lượng. Chất thơm có thể lấy từ nguồn thiên
nhiên bằng cách chưng cất hoa, lá hoặc cây các loài thực vật, hoặc hoàn toàn
bằng con đường hóa học. Tuy nhiên việc tách chiết chúng là một việc khó khăn
đòi hỏi một quy trình phức tạp và ít hiệu quả kinh tế, bên cạnh đó với các sản
phẩm được tổng hợp bằng con đường hóa học lại ít được người tiêu dùng đón
nhận, người ta ưa chuộng sản phẩm tự nhiên hơn. Vì vậy nhiều nhà khoa học đã
tích cực tìm kiếm các hương thơm mới cũng như công nghệ mới để sản xuất các
hợp chất tự nhiên. Một trong các lĩnh vực đang nổi lên về sản xuất các hợp chất
là sử dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng enzyme và vi sinh vật cho sự
xúc tác sinh học. Sự biến đổi sinh họccác hợp chất carotenoids có vẻ như là một
sự lựa chọn hợp lý để sản xuất các hợp chất hương từ những nguyên liệu được
gọi là tự nhiên
Sinh chuyển hóa carotenoids/ β-carotene được cho là một hướng có triển
vọng để sản xuất hương thơm từ khi các chất này được xếp vào danh mục các
thành phần tự nhiên. Các hợp chất thơm tạo ra từ carotenoids/ β carotene là một
trong những nhóm quan trọng, bao gồm các sản phẩm chất thơm thu được từ quá
trình phân cắt phân tử β-carotene như β-ionone, β-cyclocitral,
dihydroactinidiolide (DHA), β-damascenone, là những hợp chất có mùi hương
hoa, quả và gỗ rất mạnh, là thành phần chính của nhiều tổ hợp hương thơm được
sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Các hợp chất
nàytồn tại trong mô tếbào thực vậtnhưng với hàm lượng rất thấp, vì vậy sự
tách chiết rất tốn kém, điều đó đặt ra những nghiên cứu phát triển những công
nghệ khác để thu nhận chúng.
2
Nguồn carotenoids/β-carotene được tìm thấy ở nhiều loài thưc vật khác
nhau như cà chua, cà rốt, các loại hoa cúc có màu vàng, quả gấc hay từ tảo
Spirulina, Dunaliella salina, từ nấm mốc nhưBlakeslea trispora, từ nấm men đỏ
Rhodotorula glutinis, R. rubra. Vì vậy, tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng
dụng công nghệ Enzyme đế sản xuất hợp chất thơm dẫn xuất carotenoids”
Mục tiêu của đề tài gồm 2 phần:
1. Thu nhận nguồn carotenoids từ các nguồn thực vật khác nhau.
2. Chuyển hóa carotenoids thành chất thơm.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về carotenoid
1.1.1. Các hợp chấtcarotenoid
Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các
loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi
khuẩn. Hiện nay người ta đã tìm được 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai
nhóm, xanthophylls và carotene(Rao và Rao, 2007). Carotenoid thuộc nhóm
tetraterpenoids (phân tử chứa 40 nguyên tử C) được tạo nên bởi 8 đơn vị
isoprenne:
CH2 = C –CH = CH2
|
CH3
Carotenoid là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo, không tantrong
nước, có màu từ vàng nhạt tới đỏ sậm tùy cấu trúc phân tử. Khác với cây cỏ, con
người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng carotenoid từ việc ăn thực
vật nhằm bảo vệ bản thân mình. Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa
từ bên ngoài.Thiên nhiên có đến khoảng 600 loại carotenoid khác nhau, trong đó
có 50 loại carotenoid hiện diện trong thực phẩm. Thế nhưng trong máu của người
có khoảng 15 loại được tìm thấy và chúng đang được chứng minh là đóng vai trò
quan trọng đối với đời sống conngười.
Carotenoid không phải là tên riêng của một chất nào mà là tên của một
nhóm các hợp chất có công thức cấu tạo tương tự nhau và tác dụng bảo vệ cơ thể
cũng tương tự nhau. Carotenoid khá quen thuộc với chúng ta là β-caroten hay
còn gọi là tiền chất của vitamin A. Trongnhữngnăm gần đây người ta còn nói
nhiều đến các carotenoid khác như lycopen, lutein và zeaxanthin .
4
1.1.2. Phân loại carotenoid
Carotenoid được chia thành 2 loại: các carotene và các xanthophyll
Các carotene có màu đỏđếnda cam, là những hydrocarbon (C40H58) có 1 mạch
ngang 18 carbon mang 4 nhóm CH3 và 9 nối đôi liên hợp, chúng khác nhau ở
các đầu chuỗi.
VD: α-carotene, β-carotene và lycopene
Các xanthophyll thường có màu vàng và trong phân tử có chứa oxi
VD: lutein và zeaxanthin
1.1.2.1. Nhóm carotene
Caroten (C40H56
) có mạchhydrocacbon không no, trong phân tử không
chứa oxy, không tan trong nước, chỉ tan trong lipit và các dung môi hữu cơ. Phần
trung tâm phân tử gồm 18 nguyên tử cacbon hình thành một hệ thống nối đôi liên
hợp, có 4 nhóm CH
3mạch nhánh.
Có 4 loại caroten quan trọng là α-caroten, β-caroten, γ-caroten và lycopen.
α-caroten, β-caroten có những vòng ionon khép kín; β-caroten có cấu tạo đối
xứng với 2 vòng β-iononenên khi thủy phân cho 2 phân tử vitamin A, còn các
caroten khác khi thủy phân chỉ cho 1 vitamin A.
a. β-caroten
Gồm những sắc tố màu vàng, cam, xanh lá có ở hoa và rau.Chúng là tiền
chất của vitamin A, khi tồn tại ở dạng tinh thể có màu đỏ đậm.β-carotene có thể
tantrong các dung môi hữu cơ không phân cực như benzen, chlorofom, hexan,
petroleum ether , ít tan trongcác dung môi phân cực nhưmethanol, ethanol và
không tan trong nước.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Lê Ngọc Tú, Hóa sinh công nghiệp, Nxb Khoa học và Kĩ thuật.
2. Nguyễn Ngọc Hưng (2010), “Xác định một số acid béo trong dầu Gấc
bằng kĩ thuật sắc ký khí”, luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học quốc gia Hà
Nội.
3. Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007). “Điều
tra hợp chất carotenoids trong một số thực vật của Việt Nam”. Tạp chí
khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự nhiên và công nghệ 23.
4. “ Tiểu luận thực phẩm chống oxy hóa’’ , Khoa công nghệ hóa học-dầu
khí, Bộ môn công nghệthực phẩm , Trường Đại học Bách khoa TPHCM
Tài Liệu Internet
5. http://d3.violet.vn/uploads/previews/49/1080302/preview.swf
6. http://***********/xem-tai-lieu/tieu-luan-sac-to-thuc-vat-carotenoid-.508905.html
7. http://www.baomoi.com/Vai-tro-cua-beta-caroten-voi-suc-khoe/82/6075930.epi
8. .http://www.caythuocquy.info.vn/old/modules.php?name=News&opcase=
detailsnews&mid=1254&mcid=245&pid=&menuid
9. http://thiensuvietnam.vn/index.php?mod=article&article=410
10. http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/8497118/1/
11. http://vi.wikipedia.org/wiki/Gấc
12. http://cyberchemvn.com/chemvn/showthread.php?t=17809
67
13. http://www.thuviensinhhoc.com/trangchu/707.html?joscclean=1&comme
ntid=876
Tài liệu nước ngoài
14. M Aguedo (2004) .“Production of Aroma Compounds from Lipids”,
Food Technol. Biotechnol. 42 (4) 327–336.
15. Zorn H, Langhoff S, Scheibner M, Berger RG(2003). “Cleavage of
beta,beta-carotene to flavor compounds by fungi”. Appl Microbiol
Biotechnol.;62(4):331-6.
16. Waché Y, Bosser-DeRatuld A, Ly,H.M., Belin JM(2002). “Co-oxidation
of beta-carotene in biphasic media”. Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic, 19-20, 197-201.
17. Peter Winterhalter, Russell Rouseff (2001). “Carotenoid-derived aroma
compounds: An introduction”. ACS Symposium Series, American
Chemical Society Chapter 1, pp 1–17.
18. Mariana Uenojo; Glaucia Maria Pastore (2010). “β-carotene
biotransformation to obtain aroma compounds”. Ciênc. Tecnol. Aliment.
vol. 30 no. 3 Campinas July/Sept.
19. Delia B. Rodriguez-Amaya, Ph.D.(1997). “Carotenoids and Food
Preparation: The Retention of Provitamin A Carotenoids in Prepared,
Processed, and Stored Foods”. C.P. 6121, 13083-970 Campinas, SP.,
Brazil.
20. Cao-Hoang Lan, Osorio Puentes Francisco Javier, Phan-Thi Hanh, Waché
Yves (2011). “Stability Of Carotenoid Extracts Of Cucurbit maxima
Towards Enzymatic Co-oxidation And Aroma Compound Generation”.
International Conference on Biotechnology and Food Science.
68
21. Aguedo. Mário, Mai Huong Ly, Belo. Isabel, Teixeira, JA.,Belin,Jean-Marc, Waché. Yves(2004). “The use of enzymes and microorganisms for
the production of aroma compounds from lipids”. Food technology and
biotechnology. 42:4. 327-336.
22. Mai Huong Ly, Lan Cao Hoang, Jean-Marc Belin and Yves Waché
(2008). “ Improved co-oxidation of beta-carotene to beta-ionone using
xanthine oxidase-generated reactive oxygen species in a multiphasic
system”, biotechnology journal,pp 220-225
23. Delia B. Rodriguez-Amaya, Ph.D, “A guide to carotenoids analysis in
foods”, Departamento de Ciência de Alimentos Faculdade de Engenharia
de Alimentos Universidade Estadual de Campinas C.P. 6121, 13083-970
Campinas, SP., Brasil.